肺炎鏈球菌是一種常定植在人體鼻咽部的革蘭氏陽(yáng)性胞外菌,感染人體后會(huì)引起細(xì)菌性肺炎、中耳炎、腦膜炎、敗血癥等,老人和小孩為易感人群。肺炎鏈球菌溶血素(PLY)作為肺炎鏈球菌一種重要的毒力因子,在肺炎鏈球菌致病機(jī)制中發(fā)揮著極其重要的作用。PLY可以與細(xì)胞膜表面的膽固醇結(jié)合,嵌入細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層,通過(guò)蛋白質(zhì)的寡聚化形成跨膜孔致細(xì)胞溶解,并且PLY引起廣泛的細(xì)胞毒性,破壞呼吸道上皮完整性,抑制上皮細(xì)胞纖毛運(yùn)動(dòng),破壞中性粒細(xì)胞的殺菌能力,改變補(bǔ)體介導(dǎo)的調(diào)理作用等。PLY還能激活宿主的天然免疫應(yīng)答系統(tǒng)產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。肺炎鏈球菌感染所誘導(dǎo)宿主機(jī)體產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子,其中IL-1α,IL-1β和IL-18對(duì)抗肺炎鏈球菌感染具有重要的作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn):肺炎鏈球菌感染巨噬細(xì)胞后,PLY通過(guò)誘導(dǎo)NLRP3和AIM2炎癥小體的組裝,活化Caspase-1,進(jìn)而參與IL-1β和IL-18的成熟與分泌過(guò)程,但是肺炎鏈球菌感染巨噬細(xì)胞中有關(guān)IL-1α成熟與分泌的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)用肺炎鏈球菌感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,研究肺炎鏈球菌感染巨噬細(xì)胞過(guò)程中IL-1α成熟與分泌機(jī)制。1.肺炎鏈球菌溶血素對(duì)IL-1α成熟與分泌的作用研究以肺炎鏈球菌野生型菌株D39和ply基因缺失型(Δply)菌株分別感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,分別用Realtime RT-PCR、ELISA及Western blotting檢測(cè)IL-1αmRNA表達(dá)水平、上清和細(xì)胞裂解物中IL-1α分泌水平及IL-1α的蛋白表達(dá)水平。同時(shí),為了進(jìn)一步驗(yàn)證肺炎鏈球菌感染巨噬細(xì)胞中PLY對(duì)IL-1α成熟與分泌的重要作用,用肺炎鏈球菌Δply菌株加上三種不同濃度的經(jīng)膽固醇處理后的rPLY感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,分析感染體系上清中IL-1α的分泌水平。試驗(yàn)結(jié)果顯示:D39和Δply感染巨噬細(xì)胞后,都能誘導(dǎo)IL-1αmRNA表達(dá),但經(jīng)Δply感染的巨噬細(xì)胞確不能引起IL-1α的成熟與分泌。與Δply相比,在D39感染上清體系中能檢測(cè)出IL-1α的成熟片段。而rPLY經(jīng)膽固醇處理后的感染體系中,其IL-1α的分泌水平下降。上述結(jié)果表明:肺炎鏈球菌感染巨噬細(xì)胞后,PLY能夠引起IL-1α分泌水平升高。其中PLY的成孔毒性是誘導(dǎo)IL-1α成熟與分泌的重要因素,但PLY不參與IL-1α的轉(zhuǎn)錄過(guò)程,只對(duì)IL-1α的成熟與分泌具有作用。2.炎癥小體和巨噬細(xì)胞吞噬作用對(duì)IL-1α成熟與分泌的影響為研究肺炎鏈球菌感染巨噬細(xì)胞中炎癥小體對(duì)IL-1α成熟與分泌的影響,利用肺炎鏈球菌野生型菌株D39分別感染炎癥小體組分缺失小鼠(WT、Caspase-1~(-/-)、ASC~(-/-))腹腔巨噬細(xì)胞,ELISA檢測(cè)感染體系中IL-1α的分泌水平變化,結(jié)果顯示W(wǎng)T、Caspase-1~(-/-)和ASC~(-/-)巨噬細(xì)胞中IL-1α的分泌水平無(wú)顯著差異。Western blotting結(jié)果顯示D39分別感染W(wǎng)T、Caspase-1~(-/-)和ASC~(-/-)巨噬細(xì)胞后,均能檢測(cè)到上清中IL-1α的成熟片段。為證實(shí)巨噬細(xì)胞吞噬作用對(duì)IL-1α成熟與分泌的影響,采用試劑阻斷方式,經(jīng)細(xì)胞松弛素B處理以抑制巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬作用,利用ELISA和Western blotting分別檢測(cè)IL-1α的分泌水平和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞在細(xì)胞松弛素B處理后,IL-1α的分泌水平降低,上清中IL-1α的成熟片段蛋白表達(dá)量較未處理組降低。試驗(yàn)結(jié)果表明:肺炎鏈球菌感染巨噬細(xì)胞中,炎癥小體不參與IL-1α成熟與分泌過(guò)程,但巨噬細(xì)胞對(duì)肺炎鏈球菌的吞噬在IL-1α的成熟與分泌中具有重要作用。3.肺炎鏈球菌感染巨噬細(xì)胞過(guò)程中calpain對(duì)IL-1α成熟與分泌的作用以D39感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,3 h后加入多種鈣蛋白酶抑制劑(calpain inhibitorⅢ,calpain inhibitorⅣ和EST)和鈣離子螯合劑BAPTA-AM,用ELISA檢測(cè)感染體系中IL-1α的分泌水平,研究肺炎鏈球菌感染巨噬細(xì)胞過(guò)程中calpain對(duì)IL-1α成熟與分泌的作用。結(jié)果顯示加入鈣蛋白酶抑制劑和BAPTA-AM后,IL-1α的分泌水平顯著降低。用Western blotting檢測(cè)上清中α-fodrin的降解片段和細(xì)胞裂解物中α-fodrin的蛋白水平,結(jié)果顯示加入多種鈣蛋白酶抑制劑和BAPTA-AM后,上清中α-fodrin的降解片段表達(dá)量下降。為明確肺炎鏈球菌感染體系中引起calpain活化的因素,試驗(yàn)先用D39和Δply菌株分別感染巨噬細(xì)胞,通過(guò)Western blotting檢測(cè)α-fodrin的降解情況。結(jié)果顯示與D39相比,Δply感染巨噬細(xì)胞體系上清中不能檢測(cè)出α-fodrin的降解片段;在基本明確Ca~(2+)濃度升高是calpain活化的又一重要誘因,我們開(kāi)展了進(jìn)一步的試驗(yàn),研究在肺炎鏈球菌感染中Ca~(2+)濃度是否參與IL-1α的成熟與分泌過(guò)程。首先加入鈣離子螯合劑EDTA、EGTA+Mg~(2+),ELISA檢測(cè)感染體系中IL-1α的分泌水平,結(jié)果顯示加入EDTA、EGTA+Mg~(2+)后,IL-1α的分泌水平顯著降低。Western blotting檢測(cè)感染上清和細(xì)胞裂解物中α-fodrin的蛋白水平,結(jié)果顯示加入EDTA、EGTA+Mg~(2+)后,上清中α-fodrin的降解片段蛋白表達(dá)量減少。我們研究還發(fā)現(xiàn)在calcium-free環(huán)境下,D39感染巨噬細(xì)胞后,IL-1α的分泌水平顯著下降。但是用Δply菌株感染巨噬細(xì)胞3 h后,加入鈣離子載體A23187后,培養(yǎng)上清體系中IL-1α的分泌水平顯著增加。肺炎鏈球菌D39與Δply菌株感染巨噬細(xì)胞,用Fluo-4 NW試劑盒每隔3 h檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度變化,結(jié)果顯示與Δply相比,D39感染后,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著增加。結(jié)果表明:肺炎鏈球菌感染巨噬細(xì)胞中,PLY引起鈣離子濃度升高,calpain活化,進(jìn)而參與IL-1α的成熟與分泌過(guò)程。上述結(jié)果表明肺炎鏈球菌經(jīng)巨噬細(xì)胞吞噬進(jìn)入胞內(nèi),釋放PLY,作用于細(xì)胞膜形成跨膜孔,促進(jìn)胞外鈣離子內(nèi)流,胞內(nèi)鈣離子濃度升高,活化calpain,誘導(dǎo)IL-1α的成熟與分泌。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R378.1
【部分圖文】：

第 1 章 文獻(xiàn)綜述9用（圖1）。與IL-1β不同，IL-1α前體和成熟形式都具有生物活性，經(jīng)切割后IL-1α與IL-1R1親和力增強(qiáng)，生物活性大大增強(qiáng)[104]。目前有研究顯示，在不同的氨基酸位點(diǎn)對(duì)IL-1α前體進(jìn)行切割后所得IL-1α成熟形式生物活性存在差異，但是其確切原因仍需進(jìn)一步研究[105]。1.2.1.2 IL-1α 的功能IL-1α可在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外發(fā)揮多重作用。在細(xì)胞內(nèi)，IL-1α以前體形式存在并發(fā)揮作用。pro-IL-1α作為細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)分化，其功能依賴(lài)于N端的核定位信號(hào)[106]。IL-1α還與一些促炎細(xì)胞因子的表達(dá)具有緊密聯(lián)系。有報(bào)道指出

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文株相比，D39 感染巨噬細(xì)胞后，IL-1α 分泌水平顯著上升（圖 3-1A），但是 PLY失不能使 TNFα 的分泌水平降低（圖 3-1B）。用不同濃度 PLY 重組蛋白（rPLY）染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)用 rPLY 感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能誘導(dǎo)產(chǎn) IL-1α，但分泌水平較低。隨著 rPLY 作用濃度的上升，IL-1α 的分泌水平隨之升，呈劑量依賴(lài)性（圖 3-1C）。

第 3 章 肺炎鏈球菌溶血素在 IL-1α成熟與分泌中的作用研究3.3.2 肺炎鏈球菌感染巨噬細(xì)胞中 PLY 的成孔毒性對(duì) IL-1α 分泌的影響PLY 是膽固醇依賴(lài)性細(xì)胞溶血素的家族成員之一，可通過(guò)與宿主細(xì)胞膜上的膽固醇結(jié)合，發(fā)揮細(xì)胞毒性，引起宿主損傷。本試驗(yàn)為了探究 PLY 的成孔毒性對(duì)IL-1α 分泌的影響，用膽固醇對(duì) rPLY 進(jìn)行預(yù)處理，減弱其成孔毒性。利用肺炎鏈球菌 ply 基因缺失型菌株Δply 加上不同濃度的處理后的 rPLY 感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，ELISA 檢測(cè)感染體系上清中 IL-1α 的分泌水平，結(jié)果顯示 rPLY 經(jīng)膽固醇處理后，引起 IL-1α 的分泌水平降低（圖 3-2）。
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