目的分離、純化、培養(yǎng)鼠脾臟原代網(wǎng)狀成纖維細胞(Fibroblastic reticular cells,FRCs),研究SFTSV對原代FRCs的感染特點及感染后FRCs基因表達的變化,了解其致死性感染的可能機制。永生化FRCs細胞,篩選出穩(wěn)定與原代細胞功能接近的克隆株。方法使用磁珠分選和流式細胞分選等技術(shù)分離、純化和體外培養(yǎng)小鼠脾臟網(wǎng)狀成纖維細胞,并通過流式細胞術(shù)和激光共聚焦技術(shù)進行純度鑒定;使用SV40大T抗原感染FRCs細胞,篩選、克隆并培養(yǎng)50代以上。使用Illumina Hi Seq 4000二代測序平臺對感染SFTSV前、后原代FRCs,克隆細胞株,進行轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq),測序結(jié)果進行基因表達分析、樣品相關(guān)性分析、差異表達基因(DEG)分析以及DEG的Gene Ontology(Go)功能和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway功能富集分析。結(jié)果成功分離、純化、并體外培養(yǎng)脾臟原代FRCs細胞(純度達99%);成功永生化FRCs細胞,得到兩個符合表型的細胞克隆:Clone01、Clone02;Clone02形態(tài)與原代FRCs接近,多色流式細胞儀檢測三種細胞純度均達到了99%;細胞形態(tài)學(xué)、生長曲線及克隆實驗提示Clone01變化較大;轉(zhuǎn)錄組測序相關(guān)性分析顯示Clone02細胞株基因表達接近于原代FRCs,基因表達分析和激光共聚焦顯微鏡驗證原代FRCs、Clone02的表型均為podoplanin和成纖維細胞抗體陽性、CD31陰性;轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)5914個感染前后的差異表達基因,其中2815個表達升高,3099個表達降低,差異表達基因分析選出了Asb13、Bbs1、Klhl8等顯著變化最顯著的十個差異表達基因。差異表達基因富集于33個GO term和20個KEGG Pathway,而GO功能分析結(jié)果顯示質(zhì)膜、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、免疫系統(tǒng)過程、翻譯的RNA聚合酶II啟動子調(diào)節(jié)、病毒顆粒、病毒顆粒成分等功能(GO terms)受到顯著影響;Pathway功能分析結(jié)果表明SFTSV與人嗜T-淋巴病毒1型、人類單純皰疹病毒和EB病毒的感染通路有部分相似,被感染后,FRCs的RNA聚合酶、核糖體及核糖體合成、m RNA的生存以及RNA的轉(zhuǎn)運等途徑有顯著改變,Wnt、TNF、Notch、MAPK信號通路受到顯著影響,另外賴氨酸降解和過氧化物酶途徑也有改變。結(jié)論FRCs細胞可以短期體外培養(yǎng)并保持性狀,體外可以被SFTSV感染;本實驗建立了與原代細胞表型接近的FRCs細胞系Clone02,不表達造血細胞標志抗原CD45和表皮細胞標志抗原CD31,表達成纖維細胞標記(fibroblast)抗原和淋巴標記抗原podoplanin,保持了原代細胞的形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)特征,是與原代FRCs基因表達接近的細胞株;Go和Pathways功能分析的結(jié)果可以部分相互驗證,一致性較好。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果為SFTSV感染FRCs提供了大量的線索,為進一步的研究提供參考和方向。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R373
【文章目錄】：
英文縮略詞表
中文摘要
英文摘要
1 前言
2 材料與方法
3 結(jié)果
4 討論
5 結(jié)論
6 參考文獻
附錄
致謝
綜述
    參考文獻

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本文編號：2835729