目的:本論文利用分子克隆的方法構(gòu)建人源PD-1(hPD-1)的兩種片段pET-22b-hPD-134-150和pET-22b-hPD-132-160的重組質(zhì)粒,測(cè)序正確后,轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)系統(tǒng)BL21宿主菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。hPD-1重組蛋白復(fù)性后,將高純度的重組蛋白作為免疫原免疫Balb/c雌性小鼠,制備hPD-1蛋白的單克隆抗體,為制備具有病理診斷價(jià)值的單克隆抗體奠定一定的基礎(chǔ)。方法:利用PCR擴(kuò)增hPD-1胞外段基因,構(gòu)建hPD-1重組質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)hPD-1蛋白后,利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗(yàn)證,利用Ni-NTA柱親和層析純化包涵體表達(dá)的hPD-1蛋白,復(fù)性后由AKTA純化系統(tǒng)進(jìn)行分子篩凝膠過濾純化。將純化后的hPD-1蛋白作為免疫原免疫Balb/c雌性小鼠。免疫小鼠三次及一次加強(qiáng)免疫后取血,利用ELISA法測(cè)定血清的滴度,將血清滴度達(dá)到106的小鼠血清進(jìn)行免疫組化(IHC)評(píng)價(jià),最后利用雜交瘤技術(shù)制備anti-hPD-1單克隆抗體,利用ELISA法和IHC法篩選出效價(jià)高、IHC染色強(qiáng)、無非特異性染色的雜交瘤細(xì)胞株。最后對(duì)本論文制備的抗體進(jìn)行亞型鑒定和純化,利用SDS-PAGE檢測(cè)純化效果以及通過IHC和Western-blot評(píng)價(jià)anti-hPD-1單克隆抗體的性能。結(jié)果:1、成功構(gòu)建pET-22b-hPD-134-150和pET-22b-hPD-132-160重組質(zhì)粒,以終濃度0.5 mM IPTG于37℃誘導(dǎo)菌株6 h獲得大量表達(dá)的hPD-1蛋白;2、利用所制備的hPD-1蛋白作為免疫原免疫Balb/c雌性小鼠,小鼠血清效價(jià)均達(dá)到106以上;IHC實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:膜定位較為清晰,陽性區(qū)域均出現(xiàn)較強(qiáng)染色;3、成功制備分泌anti-hPD-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,最終篩選出四株雜交瘤細(xì)胞11F5-C9、9C12-A3、9C12-C8、9C12-C9;其中9C12-C8細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體亞型是重鏈為IgG2a,輕鏈為κ型。四株細(xì)胞產(chǎn)生的抗體應(yīng)用于IHC上均具有清晰的膜定位,陽性區(qū)域強(qiáng)著色,背景干凈且非特異性染色少,同時(shí)也可應(yīng)用于Western-blot檢測(cè);結(jié)論:在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)hPD-132-160蛋白作為免疫原,成功制備特異性強(qiáng)、親和力高的anti-hPD-1單克隆抗體,在IHC實(shí)驗(yàn)上可獲得清晰的膜染色,達(dá)到商業(yè)化要求。
【學(xué)位單位】：福州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

原攝取與呈遞功能，恢復(fù)促炎癥因子ＴＮＦ－ｃｃ和ＩＬ－６的產(chǎn)生，進(jìn)而恢復(fù)免疫細(xì)胞的活??性［３（）］。以上這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌｓ途徑能夠抑制ＤＣ細(xì)胞的抗原攝取和遞??呈功能，從而抑制免疫效應(yīng)的產(chǎn)生。??１．２．２?ＰＤ－ｌ／ＰＤ－Ｌｓ途徑介導(dǎo)Ｔ細(xì)胞抑芾ＩＪ??ＰＤ－１常以單體的形式表達(dá)于多種免疫細(xì)胞表面，在Ｔ淋巴細(xì)胞的表面也可檢測(cè)??到ＰＤ－１的高表達(dá)。當(dāng)Ｔ細(xì)胞表面ＰＤ－１受體與其配體ＰＤ－Ｌ１或ＰＤ－Ｌ２結(jié)合后，可負(fù)??性調(diào)控Ｔ細(xì)胞，導(dǎo)致Ｔ細(xì)胞免疫衰竭［３１］。其作用機(jī)制是：當(dāng)ＰＤ－１識(shí)別其配體ＰＤ－Ｌｓ??并與之結(jié)合，使得ＰＤ－１胞漿區(qū)的ＩＴＳＭ蛋白序列磷酸化，進(jìn)而募集酪氨酸磷酸酶??ＳＨＰ－１和ＳＨＰ－２。酪氨酸磷酸酶能使下游的效應(yīng)分子磷脂酰肌醇激酶３?（ＰＩ３Ｋ）發(fā)生??去磷酸化，導(dǎo)致蛋白激酶Ａｋｔ活化誘導(dǎo)失敗。Ａｋｔ的活化失敗會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄因子ＮＦ－ｋＢ??的活化，抗凋亡蛋白Ｂｃｌ－２與促生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子Ｃ－ｍｙｃ表達(dá)下調(diào)，ＩＬ－２分泌及葡萄糖代??謝減少，從而抑制Ｔ細(xì)胞分化、增殖和細(xì)胞因子分泌。此外，ＳＨＰ－２也可使ＴＣＲ信??號(hào)相關(guān)的ＺＡＰ７０、ＣＤ－３；；及ＰＬＣ－ｙ去磷酸化，抑制下游信號(hào)［３２？］。??ＰＤ－Ｌ１??

??Ｊ??圖１－１?ＰＤ－ｌ／ＰＤ－Ｌｓ途徑介導(dǎo)Ｔ細(xì)胞抑制??進(jìn)一步的研宄表明：ＰＤ－ｌ／ＰＤ－Ｌｓ途徑對(duì)ＣＤ８＋Ｔ細(xì)胞的抑制效果要明顯高于??ＣＤ４＋Ｔ細(xì)胞。由于ＣＤ４＋Ｔ細(xì)胞能夠自分泌產(chǎn)生ＩＬ－２，?ＩＬ－２可以與Ｔ細(xì)胞表面的受體??３??

圖１－３抗體結(jié)構(gòu)圖??
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本文編號(hào)：2835534