目的:研究線粒體酸-5(mitochonic acid-5,MA-5)對LPS損傷小膠質(zhì)細的保護作用及機制。方法1.MTT法檢測小膠質(zhì)細胞BV-2細胞活性,半胱天冬酶3(caspase-3)活性檢測及TUNEL法檢測細胞凋亡;2.通過JC1染色法、mPTP開放率及細胞內(nèi)鈣含量檢測線粒體膜電位變化;3.使用siRNA沉默Mfn2,蛋白免疫印跡法(Western Blotting)檢測Mfn2及凋亡蛋白半胱天冬酶-3(Caspase-3)、半胱天冬酶-9(Caspase-9)表達,并同時檢測Caspase-3、Caspase-9活性;應用線粒體溶酶體熒光共定位觀察線粒體自噬。4、ATP水平試劑盒檢測線粒體ATP水平、免疫熒光檢測細胞內(nèi)ROS以及非氧化型心肌磷脂表達水平;5.通過Transwell檢測以及細胞骨架肌動蛋白微絲F-actin免疫染色檢測細胞遷移。結(jié)果1.MA-5保護小神經(jīng)膠質(zhì)細胞BV-2免受LPS誘導的細胞凋亡。與對照組相比,LPS能顯著降低細胞活力,Caspase-3活性增加,增加細胞凋亡數(shù)量,使用MA-5后,能增加LPS處理后的BV-2細胞的活力,減少凋亡數(shù)量,表明MA-5保護小神經(jīng)膠質(zhì)細胞BV-2免受LPS誘導的細胞凋亡。2.MA-5抑制LPS誘導的線粒體損傷。MA-5使LPS處理的BV-2細胞線粒體膜電位升高,細胞內(nèi)鈣超載得到緩解,半胱天冬酶9(Caspase-9)及半胱天冬酶3(Caspase-3)活性及表達下降,表明MA-5抑制LPS誘導的線粒體損傷。3.MA-5增強Mfn2相關(guān)的線粒體自噬活性。MA-5干預后,LPS處理的BV-2細胞線粒體與溶酶體融合數(shù)量增加,Mfn2的表達升高,半胱天冬酶9(Caspase-9)活性增高,用siRNA沉默Mfn2,Mfn2表達下降,線粒體和溶酶體融合數(shù)量減少,半胱天冬酶9(Caspase-9)活性降低,表明MA-5增強了線粒體自噬活性,并依賴Mfn2的表達。4.MA-5激活的線粒體自噬增強細胞能量產(chǎn)生。MA-5能增加LPS處理后的BV-2細胞ATP水平,減少ROS的產(chǎn)生,減少心肌磷脂的氧化。siRNA沉默Mfn2后,MA-5的逆轉(zhuǎn)作用消失。5.MA-5增強線粒體自噬促進LPS誘導的炎性損傷后BV-2細胞的遷移。MA-5能增加LPS處理后的BV-2細胞遷移數(shù)量,增加F-actin的表達,siRNA沉默Mfn2后,MA-5的逆轉(zhuǎn)作用消失。表明MA-5增強線粒體自噬促進LPS誘導的炎性損傷后BV-2細胞的遷移。結(jié)論MA-5激活線粒體自噬能保護LPS損傷小膠質(zhì)細胞BV-2,其機制可能是通過Mfn2所介導。
【學位單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R364.5
【部分圖文】：

圖 3.1 MA-5 以劑量依賴型方式緩解 LPS 誘導的 BV-2 細胞凋亡。A：MTT 法檢測；B：Caspase 3的活性檢測；C-D：TUNEL 檢測細胞凋亡。*P＜0.05。3.2 MA-5 抑制 LPS 誘導的線粒體損傷為了進一步研究 MA-5 對 BV-2 細胞凋亡的保護作用，我們重點研究了線粒體損傷對細胞凋亡的影響，炎癥相關(guān)的神經(jīng)細胞損傷的機制之一是線粒體損傷引起的細胞凋亡[14]。我們用 JC-1 染色法測量了 LPS 誘導 BV-2 細胞線粒體膜電位的變化。結(jié)果表示，經(jīng) LPS 處理后，BV-2 細胞線粒體膜電位降低（圖 3.2 A），紅-綠熒光強度比值降低（圖3.2 B）；MA-5 可逆轉(zhuǎn)線粒體膜電位的這種變化。線粒體膜電位的喪失主要是由于過量的 mPTP 開放，這導致質(zhì)子泄漏到細胞質(zhì)中，導致代謝性酸中毒。我們通過鈣黃素-AM來檢測線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔mPTP的開放率，

圖 3.2 A-B：JC-1 法檢測線粒體膜電位；C：mPTP 的開放率檢測。*P＜0.05。由于線粒體膜上 mPTP 的過度開放，線粒體將線粒體中的鈣離子通過 mPTP 釋放到細胞質(zhì)中，導致細胞中鈣超載[17]。我們使用鈣離子熒光探針 Fluo-2 經(jīng)流式細胞儀來分析細胞中的鈣離子含量，我們發(fā)現(xiàn) MA-5 的處理能緩解由 LPS 誘導的細胞鈣超載(圖3.3 A)。由于 mPTP 開放，線粒體中將促凋亡因子釋放到細胞質(zhì)中，促凋亡因子進一步促進 Caspase-9 和 Caspase-3 的激活。通過對 Caspase-9 和 Caspase-3 的活性檢測，發(fā)現(xiàn) LPS處理后，BV-2 細胞 Caspase-9 和 Caspase-3 的活性升高，這表明線粒體凋亡被激活；反之，經(jīng)過 MA-5 處理，Caspase-9 和 Caspase-3 的活性降低（圖 3.3 B-C）。以上結(jié)果表明，LPS 通過線粒體途徑促進 BV-2 細胞凋亡，并且 MA-5 通過維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能，來抑制細胞凋亡。

圖 3.3A：流式細胞儀檢測細胞內(nèi)鈣離子水平；B：Caspase 3 活性檢測；C：Caspase 9 活性檢測；D：Western blot 結(jié)果。*P＜0.05。3.3 MA-5 增強 Mfn2 相關(guān)的線粒體自噬活性線粒體自噬可以清除和降解損傷的線粒體，維護線粒體穩(wěn)態(tài)和正常生理功能，從而保護線粒體免受炎癥損傷[48], 本部分主要是探討 MA-5 是否是通過增強 Mfn2 相關(guān)的線粒體自噬來抑制 BV-2 細胞凋亡。首先，我們應用線粒體和溶酶體免疫熒光共染色的方法觀察線粒體自噬活性。通過對線粒體和溶酶體的共染色，線粒體呈現(xiàn)綠色熒光，溶酶體呈現(xiàn)紅色熒光，細胞核呈現(xiàn)藍色熒光。經(jīng) LPS 的處理后，BV-2 細胞中與溶酶體融合的線粒體的數(shù)量水平降低，表明線粒體自噬的活性被抑制；MA-5處理的 BV-2 細胞中，與溶酶體特異性融合

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