目的:研究線粒體酸-5(mitochonic acid-5,MA-5)對(duì)LPS損傷小膠質(zhì)細(xì)的保護(hù)作用及機(jī)制。方法1.MTT法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2細(xì)胞活性,半胱天冬酶3(caspase-3)活性檢測及TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡;2.通過JC1染色法、mPTP開放率及細(xì)胞內(nèi)鈣含量檢測線粒體膜電位變化;3.使用siRNA沉默Mfn2,蛋白免疫印跡法(Western Blotting)檢測Mfn2及凋亡蛋白半胱天冬酶-3(Caspase-3)、半胱天冬酶-9(Caspase-9)表達(dá),并同時(shí)檢測Caspase-3、Caspase-9活性;應(yīng)用線粒體溶酶體熒光共定位觀察線粒體自噬。4、ATP水平試劑盒檢測線粒體ATP水平、免疫熒光檢測細(xì)胞內(nèi)ROS以及非氧化型心肌磷脂表達(dá)水平;5.通過Transwell檢測以及細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白微絲F-actin免疫染色檢測細(xì)胞遷移。結(jié)果1.MA-5保護(hù)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞BV-2免受LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。與對(duì)照組相比,LPS能顯著降低細(xì)胞活力,Caspase-3活性增加,增加細(xì)胞凋亡數(shù)量,使用MA-5后,能增加LPS處理后的BV-2細(xì)胞的活力,減少凋亡數(shù)量,表明MA-5保護(hù)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞BV-2免受LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。2.MA-5抑制LPS誘導(dǎo)的線粒體損傷。MA-5使LPS處理的BV-2細(xì)胞線粒體膜電位升高,細(xì)胞內(nèi)鈣超載得到緩解,半胱天冬酶9(Caspase-9)及半胱天冬酶3(Caspase-3)活性及表達(dá)下降,表明MA-5抑制LPS誘導(dǎo)的線粒體損傷。3.MA-5增強(qiáng)Mfn2相關(guān)的線粒體自噬活性。MA-5干預(yù)后,LPS處理的BV-2細(xì)胞線粒體與溶酶體融合數(shù)量增加,Mfn2的表達(dá)升高,半胱天冬酶9(Caspase-9)活性增高,用siRNA沉默Mfn2,Mfn2表達(dá)下降,線粒體和溶酶體融合數(shù)量減少,半胱天冬酶9(Caspase-9)活性降低,表明MA-5增強(qiáng)了線粒體自噬活性,并依賴Mfn2的表達(dá)。4.MA-5激活的線粒體自噬增強(qiáng)細(xì)胞能量產(chǎn)生。MA-5能增加LPS處理后的BV-2細(xì)胞ATP水平,減少ROS的產(chǎn)生,減少心肌磷脂的氧化。siRNA沉默Mfn2后,MA-5的逆轉(zhuǎn)作用消失。5.MA-5增強(qiáng)線粒體自噬促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的炎性損傷后BV-2細(xì)胞的遷移。MA-5能增加LPS處理后的BV-2細(xì)胞遷移數(shù)量,增加F-actin的表達(dá),siRNA沉默Mfn2后,MA-5的逆轉(zhuǎn)作用消失。表明MA-5增強(qiáng)線粒體自噬促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的炎性損傷后BV-2細(xì)胞的遷移。結(jié)論MA-5激活線粒體自噬能保護(hù)LPS損傷小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2,其機(jī)制可能是通過Mfn2所介導(dǎo)。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R364.5
【部分圖文】：

圖 3.1 MA-5 以劑量依賴型方式緩解 LPS 誘導(dǎo)的 BV-2 細(xì)胞凋亡。A：MTT 法檢測；B：Caspase 3的活性檢測；C-D：TUNEL 檢測細(xì)胞凋亡。*P＜0.05。3.2 MA-5 抑制 LPS 誘導(dǎo)的線粒體損傷為了進(jìn)一步研究 MA-5 對(duì) BV-2 細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，我們重點(diǎn)研究了線粒體損傷對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，炎癥相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制之一是線粒體損傷引起的細(xì)胞凋亡[14]。我們用 JC-1 染色法測量了 LPS 誘導(dǎo) BV-2 細(xì)胞線粒體膜電位的變化。結(jié)果表示，經(jīng) LPS 處理后，BV-2 細(xì)胞線粒體膜電位降低（圖 3.2 A），紅-綠熒光強(qiáng)度比值降低（圖3.2 B）；MA-5 可逆轉(zhuǎn)線粒體膜電位的這種變化。線粒體膜電位的喪失主要是由于過量的 mPTP 開放，這導(dǎo)致質(zhì)子泄漏到細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致代謝性酸中毒。我們通過鈣黃素-AM來檢測線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔mPTP的開放率，

圖 3.2 A-B：JC-1 法檢測線粒體膜電位；C：mPTP 的開放率檢測。*P＜0.05。由于線粒體膜上 mPTP 的過度開放，線粒體將線粒體中的鈣離子通過 mPTP 釋放到細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致細(xì)胞中鈣超載[17]。我們使用鈣離子熒光探針 Fluo-2 經(jīng)流式細(xì)胞儀來分析細(xì)胞中的鈣離子含量，我們發(fā)現(xiàn) MA-5 的處理能緩解由 LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞鈣超載(圖3.3 A)。由于 mPTP 開放，線粒體中將促凋亡因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，促凋亡因子進(jìn)一步促進(jìn) Caspase-9 和 Caspase-3 的激活。通過對(duì) Caspase-9 和 Caspase-3 的活性檢測，發(fā)現(xiàn) LPS處理后，BV-2 細(xì)胞 Caspase-9 和 Caspase-3 的活性升高，這表明線粒體凋亡被激活；反之，經(jīng)過 MA-5 處理，Caspase-9 和 Caspase-3 的活性降低（圖 3.3 B-C）。以上結(jié)果表明，LPS 通過線粒體途徑促進(jìn) BV-2 細(xì)胞凋亡，并且 MA-5 通過維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能，來抑制細(xì)胞凋亡。

圖 3.3A：流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平；B：Caspase 3 活性檢測；C：Caspase 9 活性檢測；D：Western blot 結(jié)果。*P＜0.05。3.3 MA-5 增強(qiáng) Mfn2 相關(guān)的線粒體自噬活性線粒體自噬可以清除和降解損傷的線粒體，維護(hù)線粒體穩(wěn)態(tài)和正常生理功能，從而保護(hù)線粒體免受炎癥損傷[48], 本部分主要是探討 MA-5 是否是通過增強(qiáng) Mfn2 相關(guān)的線粒體自噬來抑制 BV-2 細(xì)胞凋亡。首先，我們應(yīng)用線粒體和溶酶體免疫熒光共染色的方法觀察線粒體自噬活性。通過對(duì)線粒體和溶酶體的共染色，線粒體呈現(xiàn)綠色熒光，溶酶體呈現(xiàn)紅色熒光，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。經(jīng) LPS 的處理后，BV-2 細(xì)胞中與溶酶體融合的線粒體的數(shù)量水平降低，表明線粒體自噬的活性被抑制；MA-5處理的 BV-2 細(xì)胞中，與溶酶體特異性融合

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