發(fā)布時(shí)間：2020-10-09 20:37

　　 基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)是一種通過(guò)伊蚊傳播的甲病毒,它在非洲、南亞、東南亞等地區(qū)周期性暴發(fā),感染率極高~([1])。CHIKV感染導(dǎo)致基孔肯雅熱(Chikungunya fever,CHIKF),患者會(huì)出現(xiàn)包括高熱、關(guān)節(jié)疼痛、皮疹等臨床癥狀,嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡~([2])。CHIKV已在全球100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)出現(xiàn),造成全球范圍內(nèi)每年大約100萬(wàn)人感染~([3])。2017年,WHO發(fā)布了10種優(yōu)先研究的潛在傳染病,CHIKF榜上有名。目前,尚無(wú)針對(duì)此病毒的疫苗和藥物上市。由于研究CHIKV所需的實(shí)驗(yàn)室生物安全等級(jí)高,缺乏經(jīng)濟(jì)有效的動(dòng)物模型,限制了針對(duì)此病毒的藥物和疫苗研發(fā)。本課題的設(shè)計(jì)思路是構(gòu)建高滴度的CHIKV假病毒,并建立可視化的假病毒小鼠感染模型,繼而建立一套安全、全面、合理的體內(nèi)外中和抗體檢測(cè)方法,從而可在BSL-2實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下,對(duì)疫苗有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究利用密碼子優(yōu)化后的CHIKV膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCMV3.1-CHIKV進(jìn)行假病毒的構(gòu)建,對(duì)影響假病毒滴度的因素進(jìn)行優(yōu)化,確定了包裝條件:利用轉(zhuǎn)染試劑lipo3000,以膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCMV3.1-CHIKV與骨架質(zhì)粒pSG3Δenv.cmv.Fluc 1:2的比例轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48h后收取上清。最終制備的CHIKV假病毒滴度可達(dá)1.0×10~7TCID_(50)/mL。利用已構(gòu)建的CHIKV假病毒在細(xì)胞水平建立中和活性檢測(cè)方法并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化研究。對(duì)假病毒敏感細(xì)胞、細(xì)胞和病毒加入量、檢測(cè)時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,確定其實(shí)驗(yàn)程序和參數(shù)為:將待測(cè)樣品與400 TCID_(50)的CHIKV假病毒于96孔板混合孵育1h后,加入50000/孔的293T細(xì)胞,48h后檢測(cè)發(fā)光值并計(jì)算中和抗體滴度。該方法為疫苗、單抗、小分子化合物等抗病毒制品的篩選和評(píng)價(jià)提供了平臺(tái)�；贑HIKV高滴度假病毒,首次建立了CHIKV假病毒可視化小鼠感染模型。以尾靜脈途徑(IV)感染4周齡的BALB/c小鼠,利用活體成像技術(shù),動(dòng)態(tài)觀察病毒在小鼠體內(nèi)的分布和代謝,并確定了CHIKV假病毒感染BALB/c小鼠的AID_(50)為4.9×10~3TCID_(50)。該模型的建立,使得在BSL-2環(huán)境下對(duì)CHIKV疫苗進(jìn)行體內(nèi)有效性評(píng)價(jià)成為可能。此外,本研究成功構(gòu)建了針對(duì)CHIKV的DNA疫苗,采用已建立的體外中和抗體檢測(cè)方法,對(duì)DNA疫苗免疫的豚鼠和小鼠血清進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)該疫苗可誘導(dǎo)豚鼠及小鼠產(chǎn)生高滴度中和抗體,抗體滴度(ID_(50))可達(dá)1:8000以上。利用已建立的小鼠模型,對(duì)免疫血清進(jìn)行了小鼠體內(nèi)被動(dòng)保護(hù)效果評(píng)價(jià),結(jié)果表明該抗血清對(duì)CHIKV假病毒感染小鼠具有保護(hù)作用,且保護(hù)效果與抗體滴度相關(guān)(R~2=0.66)。此外,本研究發(fā)現(xiàn),提前給予小鼠GM-CSF刺激,并采用電穿孔技術(shù)輔助免疫,能使DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更高滴度的中和抗體(p0.0005),且抗體滴度與保護(hù)效果相關(guān)(R~2=0.73)。將被動(dòng)免疫與主動(dòng)免疫的保護(hù)效果進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn),兩者的保護(hù)效果無(wú)顯著性差異(p=0.37)。此結(jié)果肯定了中和抗體在抗CHIKV假病毒感染中發(fā)揮的主要作用�？傊�,本研究成功構(gòu)建了高滴度CHIKV假病毒,并于國(guó)內(nèi)外首次建立了可視化的CHIKV假病毒小鼠感染模型。基于此建立了安全性好、靈敏度高的體內(nèi)外中和活性評(píng)價(jià)方法。此檢測(cè)平臺(tái)可在BSL-2實(shí)驗(yàn)室操作,對(duì)于藥物、疫苗、單抗等抗病毒制品的有效性評(píng)價(jià)提供了理想的檢測(cè)方法。
【學(xué)位單位】：中國(guó)食品藥品檢定研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R392
【部分圖文】：

中國(guó)食品藥品檢定研究院碩士畢業(yè)論文非結(jié)構(gòu)蛋白 nsP1 是一種含有 535 個(gè)氨基酸殘基的棕櫚�；鞍�，具有甲基轉(zhuǎn)移酶和鳥(niǎo)苷�；D(zhuǎn)移酶的活性，參與病毒基因組 RNA 的合成[16]。nsP2 是一種 C-端具有蛋白水解結(jié)構(gòu)域的多功能蛋白，表現(xiàn)出半胱氨酸蛋白酶活性[6, 17]。此外，nsP2 還具有三磷酸酶和解旋酶活性，參與 RNA 的加工[18]。nsP3 的功能不詳，可能具有部分復(fù)制酶功能[13, 19]。nsP4 是 RNA 依賴(lài)的 RNA 聚合酶[20]。根據(jù)遺傳譜系分析，CHIKV包括1個(gè)血清型，3個(gè)基因型：西非型（Western Africangenotype）、東-中-南非洲型（East-Central-Southern African genotype）、亞洲型（Asiangenotype）[21]。

圖 1.2 CHIKV 世界范圍內(nèi)流行區(qū)域[38]1.5 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)由于 CHIKV、登革病毒（Dengue virus）和寨卡病毒（Zika virus）具有相似的臨床感染癥狀，常用實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)將其區(qū)分開(kāi)來(lái)[39]。針對(duì) CHIKV，目前常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有分離病毒、檢測(cè)病毒 RNA、分子生物學(xué)及特異性抗體檢測(cè)等[40]。CHIKV 通過(guò)血漿、血清或全血分離，之后可在體內(nèi)外進(jìn)行培養(yǎng)鑒定。Vero 細(xì)胞、BHK 21 細(xì)胞和 RD 細(xì)胞等都可用于 CHIKV 的分離培養(yǎng)。另外，可將病毒通過(guò)顱內(nèi)注射乳鼠，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)培養(yǎng)傳代。分離后的病毒可用血清學(xué)方法進(jìn)行鑒定[40, 41]。CHIKV 的血清學(xué)檢測(cè)主要包括間接免疫熒光法（Indirect immunofluorescenceassay，IFA）、酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、血凝抑制試驗(yàn)（Hemagglutionation inhibition，HI）和空斑減少中和試驗(yàn)（Plaquereduction neutralization test，PRNT）等。ELISA 可檢測(cè)抗 CHIKV 特異性 IgM 和 IgG抗體，IgM抗體在病毒感染后4-7天即可檢測(cè)出來(lái)，IgG抗體提示病人進(jìn)入恢復(fù)期[42]

中國(guó)食品藥品檢定研究院碩士畢業(yè)論文2 實(shí)驗(yàn)材料和方法料體表達(dá)載體 pcDNA3.1(+)達(dá)載體 pcDNA3.1(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存，用于 CHIKV 膜蛋白的表 疫苗載體 pDRVISV1.0苗載體 pDRVISV1.0 由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）邵一鳴教HIKV DNA 疫苗。

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本文編號(hào)：2834166