目的:改進大鼠AEC-Ⅱ細胞的分離方法,并對AEC-Ⅱ細胞體外培養(yǎng)方法進行改良,探索一種體外培養(yǎng)時能有效維持AEC-Ⅱ細胞表型的方法。方法:經(jīng)氣管持續(xù)注入0.25%胰蛋白酶和0.1%I型膠原酶消化大鼠肺組織獲取大鼠AEC-Ⅱ細胞,大鼠IgG免疫粘附法、差異貼壁法提純細胞,臺盼藍染色和流式細胞術(shù)檢測細胞活力,雙標免疫熒光法、透射電鏡技術(shù)鑒定細胞。分離、提純后的隨機細胞分為A組(SAGM+1%FBS培養(yǎng))、B組(SAGM+10%FBS培養(yǎng))、C組(DMEM+1%FBS培養(yǎng))、D組(DMEM+10%FBS培養(yǎng))4組,分別予以不同培養(yǎng)基聯(lián)合不同濃度的血清進行培養(yǎng),于培養(yǎng)后的第8、10、12天收集細胞,Real-time PCR檢測SP-A、SP-B、SP-C的表達以評估肺泡Ⅱ型上皮細胞表型維持情況。結(jié)果:持續(xù)氣管內(nèi)注入消化酶分離大鼠AEC-Ⅱ細胞,經(jīng)純化后可獲得細胞產(chǎn)量達2×10~7-5×10~7/ml,經(jīng)臺盼藍染色檢測細胞活力達(91±1.7)%,流式細胞術(shù)檢測細胞活力達(90.3±1.2)%,經(jīng)SP-C免疫熒光染色評估細胞純度可達(90±1.2)%。為了研究AEC-Ⅱ細胞表型維持情況,Real-time PCR檢測四組細胞SP-A、SP-B、SP-C的相對表達量:(1)培養(yǎng)至第8天時,與A組細胞相比,B組、C組細胞表達三種物質(zhì)的量明顯減少,p0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與B組、C組細胞比較,D組細胞表達三種物質(zhì)的量明顯下降p0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;(2)培養(yǎng)至第10天時,與A組細胞相比,B組、C組細胞表達三種物質(zhì)的量明顯減少,p0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與B組、C組細胞比較,D組細胞表達三種物質(zhì)的量明顯下降p0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;(3)培養(yǎng)至第12天時,與A組細胞相比,B組、C組細胞表達三種物質(zhì)的量明顯減少,p0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與B組、C組細胞比較,D組細胞表達三種物質(zhì)的量明顯下降p0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:1.持續(xù)氣管內(nèi)注入消化酶分離大鼠AEC-Ⅱ細胞能有效提高消化效率。2.SAGM+1%FBS體外培養(yǎng)大鼠AEC-Ⅱ細胞時能較長時間維持其表型。
【學(xué)位單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位畢業(yè)論文 蒲清瑚結(jié) 果大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞分離、純化結(jié)果經(jīng)分離、純化后每只大鼠每個肺平均可獲得 AEC-Ⅱ細胞的量為 2×107-5×107n=24），經(jīng)臺盼藍染色評估細胞活力達（91±1.7）%（n=24），流式細胞術(shù)評估細活力達（90.3±1.2）%（n=24），經(jīng) SP-C 免疫熒光染色評估細胞純度可達（90±1.2）%n=12）流式細胞術(shù)檢測細胞活力通過流式細胞術(shù)檢測細胞的壞死和凋亡率，間接反映細胞的活力。經(jīng)流式細胞評估細胞活力達（90.3±1.2）%，與臺盼藍染色評估細胞活力相當。

院碩士學(xué)位畢業(yè)論文 蒲清相差顯微鏡下觀察 AEC-Ⅱ細胞生長情況分離提純后的細胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，接種 16-24 小時細胞開始貼壁生長(a)，右細胞開始聚集在一起，呈小島狀生長（b），細胞呈圓形或立方形（AEC態(tài)學(xué)特點），胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的顆粒物質(zhì)，72-96 小時細胞平展呈多邊形，成細胞單層（c），10 天左右無法辨認 AEC-Ⅱ細胞形態(tài)（d）。a b

第 18 頁圖 3 SP-C、Cytokeratin-8 雙標免疫熒光法鑒定 AEC-Ⅱ細胞：原代培養(yǎng)的細胞制作細胞爬片，當細胞長滿爬片的 80%以上，進行免疫熒光染色，倒置熒光顯微鏡下觀察拍片。SP-C 主要分布于細胞漿，呈顆粒型（圖 B），CK-8 著色為綠色（圖 C），橙色為紅色和綠色的疊加（圖 D）。當二者在同一細胞中表達，能充分說明該細胞為 AEC-Ⅱ。（×200）

【參考文獻】

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本文編號：2830498