目的:改進(jìn)大鼠AEC-Ⅱ細(xì)胞的分離方法,并對(duì)AEC-Ⅱ細(xì)胞體外培養(yǎng)方法進(jìn)行改良,探索一種體外培養(yǎng)時(shí)能有效維持AEC-Ⅱ細(xì)胞表型的方法。方法:經(jīng)氣管持續(xù)注入0.25%胰蛋白酶和0.1%I型膠原酶消化大鼠肺組織獲取大鼠AEC-Ⅱ細(xì)胞,大鼠IgG免疫粘附法、差異貼壁法提純細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活力,雙標(biāo)免疫熒光法、透射電鏡技術(shù)鑒定細(xì)胞。分離、提純后的隨機(jī)細(xì)胞分為A組(SAGM+1%FBS培養(yǎng))、B組(SAGM+10%FBS培養(yǎng))、C組(DMEM+1%FBS培養(yǎng))、D組(DMEM+10%FBS培養(yǎng))4組,分別予以不同培養(yǎng)基聯(lián)合不同濃度的血清進(jìn)行培養(yǎng),于培養(yǎng)后的第8、10、12天收集細(xì)胞,Real-time PCR檢測(cè)SP-A、SP-B、SP-C的表達(dá)以評(píng)估肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表型維持情況。結(jié)果:持續(xù)氣管內(nèi)注入消化酶分離大鼠AEC-Ⅱ細(xì)胞,經(jīng)純化后可獲得細(xì)胞產(chǎn)量達(dá)2×10~7-5×10~7/ml,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力達(dá)(91±1.7)%,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活力達(dá)(90.3±1.2)%,經(jīng)SP-C免疫熒光染色評(píng)估細(xì)胞純度可達(dá)(90±1.2)%。為了研究AEC-Ⅱ細(xì)胞表型維持情況,Real-time PCR檢測(cè)四組細(xì)胞SP-A、SP-B、SP-C的相對(duì)表達(dá)量:(1)培養(yǎng)至第8天時(shí),與A組細(xì)胞相比,B組、C組細(xì)胞表達(dá)三種物質(zhì)的量明顯減少,p0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與B組、C組細(xì)胞比較,D組細(xì)胞表達(dá)三種物質(zhì)的量明顯下降p0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(2)培養(yǎng)至第10天時(shí),與A組細(xì)胞相比,B組、C組細(xì)胞表達(dá)三種物質(zhì)的量明顯減少,p0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與B組、C組細(xì)胞比較,D組細(xì)胞表達(dá)三種物質(zhì)的量明顯下降p0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(3)培養(yǎng)至第12天時(shí),與A組細(xì)胞相比,B組、C組細(xì)胞表達(dá)三種物質(zhì)的量明顯減少,p0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與B組、C組細(xì)胞比較,D組細(xì)胞表達(dá)三種物質(zhì)的量明顯下降p0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1.持續(xù)氣管內(nèi)注入消化酶分離大鼠AEC-Ⅱ細(xì)胞能有效提高消化效率。2.SAGM+1%FBS體外培養(yǎng)大鼠AEC-Ⅱ細(xì)胞時(shí)能較長(zhǎng)時(shí)間維持其表型。
【學(xué)位單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位畢業(yè)論文 蒲清瑚結(jié) 果大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分離、純化結(jié)果經(jīng)分離、純化后每只大鼠每個(gè)肺平均可獲得 AEC-Ⅱ細(xì)胞的量為 2×107-5×107n=24），經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估細(xì)胞活力達(dá)（91±1.7）%（n=24），流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)活力達(dá)（90.3±1.2）%（n=24），經(jīng) SP-C 免疫熒光染色評(píng)估細(xì)胞純度可達(dá)（90±1.2）%n=12）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活力通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的壞死和凋亡率，間接反映細(xì)胞的活力。經(jīng)流式細(xì)胞評(píng)估細(xì)胞活力達(dá)（90.3±1.2）%，與臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估細(xì)胞活力相當(dāng)。

院碩士學(xué)位畢業(yè)論文 蒲清相差顯微鏡下觀察 AEC-Ⅱ細(xì)胞生長(zhǎng)情況分離提純后的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，接種 16-24 小時(shí)細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)(a)，右細(xì)胞開(kāi)始聚集在一起，呈小島狀生長(zhǎng)（b），細(xì)胞呈圓形或立方形（AEC態(tài)學(xué)特點(diǎn)），胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的顆粒物質(zhì)，72-96 小時(shí)細(xì)胞平展呈多邊形，成細(xì)胞單層（c），10 天左右無(wú)法辨認(rèn) AEC-Ⅱ細(xì)胞形態(tài)（d）。a b

第 18 頁(yè)圖 3 SP-C、Cytokeratin-8 雙標(biāo)免疫熒光法鑒定 AEC-Ⅱ細(xì)胞：原代培養(yǎng)的細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿爬片的 80%以上，進(jìn)行免疫熒光染色，倒置熒光顯微鏡下觀察拍片。SP-C 主要分布于細(xì)胞漿，呈顆粒型（圖 B），CK-8 著色為綠色（圖 C），橙色為紅色和綠色的疊加（圖 D）。當(dāng)二者在同一細(xì)胞中表達(dá)，能充分說(shuō)明該細(xì)胞為 AEC-Ⅱ。（×200）

【參考文獻(xiàn)】

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1 顧超;劉元順;呂云;曹林峰;李亞清;李娜;;Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡在肺氣腫大鼠肺功能下降中的作用研究[J];浙江臨床醫(yī)學(xué);2017年09期

2 劉國(guó)躍;牟勝旭;陳淼;惠越;梅鴻;覃松;陳濤;;一種簡(jiǎn)便可控的高氧急性肺損傷模型的建立方法[J];中華危重病急救醫(yī)學(xué);2016年01期

3 石莉;竭晶;王芳;趙丹;張秀芳;彭麗萍;;Wnt信號(hào)途徑促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分化[J];中國(guó)組織工程研究;2015年32期

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5 陳寅;馬南;梅舉;肖海波;陸善偉;徐懷陽(yáng);鐘z

本文編號(hào)：2830498