發(fā)布時(shí)間：2020-09-30 08:56

　　 第一部分蛋氨酸亞砜還原酶A在小膠質(zhì)細(xì)胞炎性激活中的作用 目的：蛋氨酸亞砜還原酶A(Methionine sulfoxide reductase A, MsrA)是蛋氨酸亞砜還原酶家族的重要成員之一,近年來由于其在體內(nèi)氧化還原過程中的作用受到了廣泛關(guān)注。MsrA表達(dá)于高等動(dòng)物的多數(shù)組織中,在心臟、肝臟等組織中表達(dá)尤為豐富。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,MsrA在包括海馬、皮層、中腦等在內(nèi)的多個(gè)腦區(qū)中均有分布。MsrA可以修復(fù)發(fā)生氧化損傷的蛋白,減緩氧化應(yīng)激,對(duì)包括神經(jīng)元在內(nèi)的多種細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用。迄今為止,關(guān)于MsrA在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)及其功能鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于氧化應(yīng)激在小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活及神經(jīng)炎癥中的重要作用,本部分實(shí)驗(yàn)旨在研究小膠質(zhì)細(xì)胞中是否存在MsrA表達(dá),以及MsrA是否對(duì)脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)具有調(diào)控作用。 方法：通過RT-PCR技術(shù)在mRNA水平確定原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中是否存在MsrAmRNA表達(dá)；通過Western blotting方法在蛋白質(zhì)水平確定原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中是否存在MsrA蛋白表達(dá)；通過對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和大鼠腦片進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記,在形態(tài)學(xué)水平確定小膠質(zhì)細(xì)胞中是否存在MsrA的表達(dá)以及MsrA的分布情況；利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)研究MsrA沉默對(duì)于LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響；通過轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組Tat-大鼠源性MsrA融合蛋白(Tat-rMsrA fusion protein, Tat-rMsrA)外源性補(bǔ)充小膠質(zhì)細(xì)胞中的MsrA,研究MsrA上調(diào)對(duì)于LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響；利用大鼠急性神經(jīng)炎癥模型,在動(dòng)物水平研究Tat-rMsrA轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞激活以及神經(jīng)炎癥的影響。 結(jié)果：(1)從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平分別證實(shí)原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中存在MsrA的表達(dá),免疫熒光證實(shí)MsrA在小膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿和胞核中均有分布；(2)LPS可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞中的MsrA表達(dá)上調(diào)；(3)慢病毒沉默小膠質(zhì)細(xì)胞中的MsrA可加劇LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；(4)向小膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA可抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；(5)在大鼠急性神經(jīng)炎癥模型中,向海馬齒狀回區(qū)域注射Tat-rMsrA可抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活以及致炎因子的產(chǎn)生。 結(jié)論：小膠質(zhì)細(xì)胞中存在MsrA的功能性表達(dá),且MsrA可負(fù)性調(diào)控LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。 第二部分蛋氨酸亞砜還原酶A負(fù)性調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞炎性激活的機(jī)制 目的：小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和活性氧(reactive oxygen species, ROS)密切相關(guān)。ROS可以作為“信號(hào)分子”激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)以及核因子-κB (nuclear-factor kappa B, NF-κB)等在小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而加劇小膠質(zhì)細(xì)胞的異�；罨约把装Y反應(yīng)。因此,內(nèi)源性的抗氧化系統(tǒng)可能是炎癥反應(yīng)加劇時(shí)重要的“剎車”機(jī)制。已有研究報(bào)道蛋氨酸氧化-還原循環(huán)在清除ROS以及保護(hù)蛋白質(zhì)的關(guān)鍵位點(diǎn)免受ROS攻擊的過程中扮演重要角色,而MsrA是調(diào)控蛋氨酸抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶,因此,本部分實(shí)驗(yàn)旨在研究小膠質(zhì)細(xì)胞中的MsrA能否通過催化ROS和蛋氨酸(methionine, Met)反應(yīng)清除LPS誘導(dǎo)的ROS生成,并進(jìn)而抑制MAPKs以及NF-κB等信號(hào)通路,從而減緩LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。 方法：通過western blotting方法檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA對(duì)于LPS誘導(dǎo)的p38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)以及核因子-κ.B抑制因子α (inhibitor of kappa B a, IκBα)磷酸化的影響；通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)研究轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA對(duì)于LPS誘導(dǎo)的NF-κB的p65亞基入核的影響；通過胞內(nèi)自由基檢測(cè)以及胞外超氧化物測(cè)定等方法研究轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA對(duì)于LPS誘導(dǎo)的ROS生成的影響；并通過電子自旋共振(electron spin resonance, ESR)、魯米諾化學(xué)發(fā)光檢測(cè)以及蛋氨酸亞砜檢測(cè)等技術(shù)研究Tat-rMsrA清除ROS的作用機(jī)制。 結(jié)果：(1)向小膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA可抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中p38、ERK等MAPKs信號(hào)通路的激活；(2)向小膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA可抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的激活；(3)向小膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA可減緩小膠質(zhì)細(xì)胞激活所引起的氧化應(yīng)激；(4) MsrA可通過催化L-蛋氨酸或蛋白質(zhì)中的蛋氨酸殘基和ROS反應(yīng)生成蛋氨酸亞砜(methionine sulfoxide, MetO),從而發(fā)揮自由基清除作用。 結(jié)論：MsrA可通過催化蛋氨酸和ROS反應(yīng),減少LPS誘導(dǎo)的ROS生成,并進(jìn)一步抑制p38、ERK以及NF-κB等信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活,從而減緩LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R36
【文章目錄】：
縮略詞表
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 蛋氨酸亞砜還原酶A在小膠質(zhì)細(xì)胞炎性激活中的作用
    一、材料與方法
    二、結(jié)果
    三、討論
    小結(jié)
第二部分 蛋氨酸亞砜還原酶A負(fù)性調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞炎性激活的機(jī)制
    一、材料與方法
    二、結(jié)果
    三、討論
    小結(jié)
全文總結(jié)
本文創(chuàng)新點(diǎn)
展望
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間已發(fā)表和待發(fā)表的論文
致謝

【共引文獻(xiàn)】

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