目的:建立新生大鼠脊髓腹角神經(jīng)元急性分離方法及單細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù),以深入研究脊髓腹角神經(jīng)元上各受體的分布、分型和作用機(jī)制,為揭開(kāi)脊髓的運(yùn)動(dòng)調(diào)制奠定基礎(chǔ),為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的治療提供思路。方法:選用鼠齡7-12 d的新生SD大鼠,麻醉后手術(shù)分離出含腰骶膨大的脊髓,修剪神經(jīng)根后,制備400-500μm厚的橫切片,置于人工腦脊液中孵育1小時(shí);后在消化酶溶液中恒溫消化20-35 mins,取出后沿中央管切除雙側(cè)背角,將剩余腹角的部分移至含標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液的培養(yǎng)皿中,用自制的玻璃吹管機(jī)械吹打,直至分離出單細(xì)胞,靜置貼壁后,進(jìn)行膜片鉗電生理記錄。通過(guò)快速給藥系統(tǒng)給予工具藥,記錄細(xì)胞產(chǎn)生的電流變化,并可以通過(guò)成像系統(tǒng)采集單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞圖像。結(jié)果:(1)分離的神經(jīng)元胞體較大,呈紡錘形、三角錐形或多角形,邊緣光整;神經(jīng)元的突起從極端發(fā)出,形態(tài)較為完整,具有分支。(2)分離的脊髓腹角神經(jīng)元基本電生理參數(shù)為:靜息電位-65.34±13.63 m V,閾電位-46.11±8.96 m V,鋒電位幅值54.51±15.17 m V,超射8.39±7.70 m V,放電頻率19.93±9.22 Hz。(n=14)(3)谷氨酸誘發(fā)電流具有濃度依賴性,EC50=0.24 m M;平均翻轉(zhuǎn)電位為17.63±10.04 m V。(4)尼古丁誘發(fā)電流具有濃度依賴性,EC50=0.08 m M;平均翻轉(zhuǎn)電位為29.06±14.88 m V。(5)記錄到的谷氨酸誘發(fā)電流達(dá)峰時(shí)間較短,受體激活較快,失敏較慢;而尼古丁受體激活較慢,失敏較快。平均上升斜率、達(dá)峰時(shí)間、平均下降斜率、失敏時(shí)間,均有顯著性差異(p0.05)。(6)6個(gè)神經(jīng)元給予α7-n ACh R選擇性阻斷劑MLA時(shí),尼古丁誘發(fā)電流并沒(méi)有產(chǎn)生顯著性變化。6個(gè)神經(jīng)元給予α4β2-n ACh R選擇性阻斷劑DHβE時(shí),其中有2個(gè)細(xì)胞尼古丁電流幅度減弱45%;而其它4個(gè)神經(jīng)元,尼古丁電流沒(méi)有被壓抑,并且同時(shí)給予MLA時(shí),均未被壓抑或阻斷。結(jié)論:按照所建立的脊髓腹角神經(jīng)元急性分離方法得到的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)良好,該急性分離方法切實(shí)可行。急性分離的脊髓腹角神經(jīng)元可記錄到穩(wěn)定而連續(xù)的自發(fā)動(dòng)作電位,神經(jīng)元可記錄到谷氨酸和尼古丁誘發(fā)的全細(xì)胞電流以及濃度依賴性反應(yīng),并可測(cè)得其翻轉(zhuǎn)電位。部分神經(jīng)元的尼古丁誘發(fā)電流可被DHβE壓抑;大部分神經(jīng)元的尼古丁誘發(fā)電流對(duì)DHβE和MLA均不敏感。我們所急性分離的脊髓腹角神經(jīng)元上誘發(fā)的尼古丁電流,部分由α4β2-n ACh R介導(dǎo);而另一部分,可能由非α4β2-非α7-n ACh R介導(dǎo)。
【學(xué)位單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R338
【部分圖文】：

圖 1. 實(shí)驗(yàn)流程。（A）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用 7-12 天新生乳大鼠；（B）取出腰骶段脊髓置于震蕩切片機(jī)中切片；（C）切片置于消化酶溶液中恒溫消化；（D）在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液中用自制的玻璃吹管機(jī)械吹打切片腹角部分；（E）急性分離的脊髓腹角神經(jīng)元置于膜片鉗實(shí)驗(yàn)臺(tái)上進(jìn)行記錄（左側(cè)為給藥管；右側(cè)為記錄電極）。Fig 1. Experimental procedure. (A) Experimental animals: neonatal SD rats aged 7-12 daysold; (B) The lumbosacral spinal cord was removed and sliced by slicer. (C) The slices weredigested in the enzyme solution with constant temperature; (D) Ventral horn neurons weremechanically dissociated by gently triturating with fire-polished Pasteur pipettes in standardsolution; (E) The acutely isolated ventral horn neurons were recorded on the patch-clampexperiment table (Drug tubes on the left; Recording electrode on the right).2.2 酶消化處理及機(jī)械分離細(xì)胞孵育完成后，將 3-4 片脊髓切片移入預(yù)通混合氧的含酶溶液（Papain，0.18g/30 ml ACSF）的小燒杯中，置于恒溫水浴箱內(nèi) 33℃ 消化 20-35 min（圖 1C），

19實(shí)驗(yàn)所采用的給藥模式（protocol）的設(shè)置。紅色框標(biāo)注為 3000 ms 沖洗-20000 ms 沖洗的模式。 The setting of drug delivery protocol for the experiment. The red frame is mas flushing -2000 ms drug delivery -3000 ms flushing mode.

之后用Clampfit 10.6以及Origin 5.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集軟件LAS V3.8拍攝和處理神經(jīng)元的形態(tài)照片，選取具有片進(jìn)行作圖；分析電流-電壓（I-V）關(guān)系時(shí)，選取具有代表細(xì)胞靜息電位時(shí)的電流幅度作為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其他不同鉗制電位歸一化處理，作出散點(diǎn)圖，繪制I-V擬合的趨勢(shì)線，根據(jù)公式的翻轉(zhuǎn)電位。所有的實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)據(jù)皆以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x ± 細(xì)胞電流幅度皆為峰電流幅度（圖 3），而非穩(wěn)態(tài)電流幅度的電流反應(yīng)統(tǒng)計(jì)分析采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，p<0.05時(shí)，差。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2825501