目的:建立新生大鼠脊髓腹角神經元急性分離方法及單細胞膜片鉗記錄技術,以深入研究脊髓腹角神經元上各受體的分布、分型和作用機制,為揭開脊髓的運動調制奠定基礎,為運動神經元疾病的治療提供思路。方法:選用鼠齡7-12 d的新生SD大鼠,麻醉后手術分離出含腰骶膨大的脊髓,修剪神經根后,制備400-500μm厚的橫切片,置于人工腦脊液中孵育1小時;后在消化酶溶液中恒溫消化20-35 mins,取出后沿中央管切除雙側背角,將剩余腹角的部分移至含標準細胞外液的培養(yǎng)皿中,用自制的玻璃吹管機械吹打,直至分離出單細胞,靜置貼壁后,進行膜片鉗電生理記錄。通過快速給藥系統(tǒng)給予工具藥,記錄細胞產生的電流變化,并可以通過成像系統(tǒng)采集單個神經細胞圖像。結果:(1)分離的神經元胞體較大,呈紡錘形、三角錐形或多角形,邊緣光整;神經元的突起從極端發(fā)出,形態(tài)較為完整,具有分支。(2)分離的脊髓腹角神經元基本電生理參數為:靜息電位-65.34±13.63 m V,閾電位-46.11±8.96 m V,鋒電位幅值54.51±15.17 m V,超射8.39±7.70 m V,放電頻率19.93±9.22 Hz。(n=14)(3)谷氨酸誘發(fā)電流具有濃度依賴性,EC50=0.24 m M;平均翻轉電位為17.63±10.04 m V。(4)尼古丁誘發(fā)電流具有濃度依賴性,EC50=0.08 m M;平均翻轉電位為29.06±14.88 m V。(5)記錄到的谷氨酸誘發(fā)電流達峰時間較短,受體激活較快,失敏較慢;而尼古丁受體激活較慢,失敏較快。平均上升斜率、達峰時間、平均下降斜率、失敏時間,均有顯著性差異(p0.05)。(6)6個神經元給予α7-n ACh R選擇性阻斷劑MLA時,尼古丁誘發(fā)電流并沒有產生顯著性變化。6個神經元給予α4β2-n ACh R選擇性阻斷劑DHβE時,其中有2個細胞尼古丁電流幅度減弱45%;而其它4個神經元,尼古丁電流沒有被壓抑,并且同時給予MLA時,均未被壓抑或阻斷。結論:按照所建立的脊髓腹角神經元急性分離方法得到的神經細胞形態(tài)良好,該急性分離方法切實可行。急性分離的脊髓腹角神經元可記錄到穩(wěn)定而連續(xù)的自發(fā)動作電位,神經元可記錄到谷氨酸和尼古丁誘發(fā)的全細胞電流以及濃度依賴性反應,并可測得其翻轉電位。部分神經元的尼古丁誘發(fā)電流可被DHβE壓抑;大部分神經元的尼古丁誘發(fā)電流對DHβE和MLA均不敏感。我們所急性分離的脊髓腹角神經元上誘發(fā)的尼古丁電流,部分由α4β2-n ACh R介導;而另一部分,可能由非α4β2-非α7-n ACh R介導。
【學位單位】：皖南醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R338
【部分圖文】：

圖 1. 實驗流程。（A）實驗動物：選用 7-12 天新生乳大鼠；（B）取出腰骶段脊髓置于震蕩切片機中切片；（C）切片置于消化酶溶液中恒溫消化；（D）在標準細胞外液中用自制的玻璃吹管機械吹打切片腹角部分；（E）急性分離的脊髓腹角神經元置于膜片鉗實驗臺上進行記錄（左側為給藥管；右側為記錄電極）。Fig 1. Experimental procedure. (A) Experimental animals: neonatal SD rats aged 7-12 daysold; (B) The lumbosacral spinal cord was removed and sliced by slicer. (C) The slices weredigested in the enzyme solution with constant temperature; (D) Ventral horn neurons weremechanically dissociated by gently triturating with fire-polished Pasteur pipettes in standardsolution; (E) The acutely isolated ventral horn neurons were recorded on the patch-clampexperiment table (Drug tubes on the left; Recording electrode on the right).2.2 酶消化處理及機械分離細胞孵育完成后，將 3-4 片脊髓切片移入預通混合氧的含酶溶液（Papain，0.18g/30 ml ACSF）的小燒杯中，置于恒溫水浴箱內 33℃ 消化 20-35 min（圖 1C），

19實驗所采用的給藥模式（protocol）的設置。紅色框標注為 3000 ms 沖洗-20000 ms 沖洗的模式。 The setting of drug delivery protocol for the experiment. The red frame is mas flushing -2000 ms drug delivery -3000 ms flushing mode.

之后用Clampfit 10.6以及Origin 5.0軟件對實驗數據進行采集軟件LAS V3.8拍攝和處理神經元的形態(tài)照片，選取具有片進行作圖；分析電流-電壓（I-V）關系時，選取具有代表細胞靜息電位時的電流幅度作為標準，對其他不同鉗制電位歸一化處理，作出散點圖，繪制I-V擬合的趨勢線，根據公式的翻轉電位。所有的實驗樣本數據皆以均數±標準差（ x ± 細胞電流幅度皆為峰電流幅度（圖 3），而非穩(wěn)態(tài)電流幅度的電流反應統(tǒng)計分析采用兩獨立樣本t檢驗，p<0.05時，差。

【參考文獻】

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本文編號：2825501