肝臟在饑餓狀態(tài)下的能量平衡調(diào)節(jié)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。饑餓早期，肝臟糖原迅速分解，維持正常的血糖濃度，同時，肝臟的糖異生也開始啟動，一些非糖物質(zhì)經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化后生成葡萄糖，入血后維持血糖濃度和提供能量。隨著饑餓時間的延長，脂肪組織分解，提供甘油和脂肪酸。甘油可以作為糖異生的原料，而脂肪酸能被進一步氧化，為全身能量供應(yīng)提供支持。肝臟在進行脂肪酸氧化過程中生成酮體，酮體入血后運送到全身多個組織器官為細胞提供能量。因此，肝臟在饑餓的能量平衡中發(fā)揮了核心作用，而這些能量平衡調(diào)控的深層次機制涉及到多種錯綜復(fù)雜的分子信號。換句話說，饑餓狀態(tài)下，糖原分解、糖異生、脂肪酸氧化、酮體生成等供能效應(yīng)，其本質(zhì)是細胞分子信號通路在饑餓環(huán)境下的適應(yīng)性調(diào)控過程。許多病理條件下，如糖尿病、脂肪肝等疾病，肝臟能量平衡相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生障礙，異常的分子調(diào)控導(dǎo)致了疾病的發(fā)生、發(fā)展。為此，深入研究肝臟代謝分子機制，可以豐富分子代謝理論，同時，為疾病的診治提供新的思路。 為適應(yīng)環(huán)境變化，信號分子在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后等水平的多重調(diào)節(jié)下發(fā)生自身表達和活性的改變，以便適應(yīng)環(huán)境變化。饑餓時，肝臟中NAD依賴的蛋白去乙酰化酶Sirt1通過翻譯后修飾（去乙�；┐龠MPGC1α、FOXO1等代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子/轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子的活性，而活化的轉(zhuǎn)錄因子/轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制增加下游代謝相關(guān)酶的表達，促進長期饑餓下肝臟的糖異生和脂肪酸氧化，調(diào)節(jié)血糖的平衡和能量供應(yīng)。可見，饑餓環(huán)境下，肝臟細胞中的代謝相關(guān)信號分子受到了不同層面的多重調(diào)控。 RNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在肝臟代謝中少有研究。STAR家族成員QKI（Quaking）是一個RNA結(jié)合蛋白，由qkI基因編碼，可產(chǎn)生多個異構(gòu)體，在全身多種組織細胞中表達。其中，QKI5主要定位于胞核，但也能穿梭到胞漿，而QKI6和QKI7主要分布在胞漿中。通過與mRNA的3UTR的特異性識別元件（QRE）結(jié)合，QKI在調(diào)節(jié)mRNA的胞漿/胞核定位、穩(wěn)定性、翻譯效率等方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在神經(jīng)系統(tǒng)，QKI能增加MBP的表達，從而增加髓鞘的形成。在結(jié)腸癌中，QKI通過影響β-catenin的亞細胞定位，發(fā)揮抑癌基因效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)，QKI同樣在肝臟表達，而有關(guān)其在肝臟中的功能尚沒有研究報道。 【目的】 （1）在體內(nèi)和體外模型中，查看QKI在肝臟饑餓能量平衡過程中的表達變化，分析QKI與糖異生、脂肪酸氧化和酮體生成的相關(guān)性； （2）在體內(nèi)和體外模型中，探討QKI是否受乙�；揎椪{(diào)節(jié)，并闡明QKI的乙�；揎椩陴囸I肝臟能量代謝中的作用； （3）分析QKI乙�；揎椀纳嫌握{(diào)節(jié)分子機制，探討上游調(diào)節(jié)分子如何影響QKI，并在饑餓肝臟代謝中發(fā)揮效應(yīng)； （4）分析受乙�；揎椪{(diào)節(jié)的QKI通過調(diào)節(jié)哪些下游關(guān)鍵分子，從而影響肝臟饑餓能量代謝，并進一步闡明QKI調(diào)節(jié)下游分子的深層次機制。 【方法和結(jié)果】 （1）在小鼠饑餓的肝臟組織、低糖和Forskolin/dexamethasone處理的HepG2細胞中，利用免疫組化、qRT-PCR和Western-blot檢測QKI的表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝臟中，QKI5是主要表達的異構(gòu)體。與對照相比，QKI5的表達呈現(xiàn)升高的趨勢。 （2）在上述饑餓模型中，使用乙�；贵w進行免疫共沉淀（IP），Western-blot檢測QKI5乙�；剑焕蒙镄畔W(xué)技術(shù)預(yù)測QKI5可能的乙�；揎椢稽c；構(gòu)建乙�；稽c突變的QKI5表達載體，探討乙�；揎椀母淖儗︷囸I肝臟能量代謝的影響。結(jié)果表明，QKI5在饑餓的肝臟中表現(xiàn)為去乙酰化狀態(tài)，而使用突變載體干預(yù)發(fā)現(xiàn)，QKI5的KH domain區(qū)賴氨酸突變?yōu)榫彼幔∕TR5，乙酰化位點缺失）時，促進肝臟糖異生、脂肪酸氧化和酮體生成；突變?yōu)楣劝滨０罚∕TQ5，相當(dāng)于乙�；陌被幔瑒t抑制糖異生、脂肪酸氧化和酮體生成。 （3）使用去乙�；窼irt1的抑制劑和激活劑，IP試驗檢測肝臟細胞QKI5的乙�；剑辉诩毎懈缮鍿irt1的表達，檢測QKI5的乙酰化水平；在Sirt1敲除的小鼠肝臟中查看QKI5的乙酰化水平。結(jié)果表明，在肝細胞中抑制Sirt1的活性，QKI5乙酰化水平增加，促進Sirt1活化，則導(dǎo)致QKI5去乙�；辉诟缮鍿irt1表達的肝細胞和Sirt1基因敲除的小鼠肝臟組織中，QKI的乙酰化水平都是升高的。 （4）在肝臟細胞中干涉QKI5、過表達QKI5、MTR5、MTQ5，結(jié)合饑餓模型刺激，qRT-PCR檢測肝臟代謝相關(guān)的關(guān)鍵分子的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干涉QKI5或過表達MTQ5能抑制FOXO1和PPARα表達，而過表達QKI5或MTR5則促進FOXO1和PPARα表達。通過RNA-IP實驗發(fā)現(xiàn)，QKI5與FOXO1和PPARα的mRNA有相互作用。 （5）通過報告系統(tǒng)實驗進一步驗證QKI5、MTR5和MTQ5對FOXO1和PPARα的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制。結(jié)果表明，過表達QKI5和MTR5能增加FOXO1和PPARα報告基因的螢光素酶活性，而過表達MTQ5則抑制其活性。 【結(jié)論】 RNA結(jié)合蛋白QKI在饑餓肝臟能量代謝中發(fā)揮了重要作用。饑餓時，肝臟Sirt1促進了QKI的去乙酰化，去乙酰化的QKI通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制促進轉(zhuǎn)錄因子FOXO1和PPARα的表達，進而促進糖異生、脂肪酸氧化及酮體生成，從而在肝臟能量平衡中發(fā)揮作用。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R333.4

【共引文獻】

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本文編號：2825322