靈芝自古便是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的珍貴藥材，被認為具有滋補強身、扶正固本之效。近代科學(xué)研究也證實靈芝的粗提物具有抗腫瘤和增強免疫力之功能，然而多數(shù)研究認為靈芝主要活性成分為多醣體及三萜類化合物，直至1989年Kino等科學(xué)家自靈芝的菌絲體純化出具有免疫調(diào)節(jié)功能的小分子蛋白質(zhì)—靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（LZ-8），確立另一種活性物質(zhì)免疫調(diào)節(jié)蛋白的存在。二十多年以來，國內(nèi)外數(shù)十家課題組對其進行了深入研究，利用多種基因工程表達系統(tǒng)獲得了重組LZ-8，揭示了LZ-8的晶體結(jié)構(gòu)和主要理化性質(zhì)，最為重要的是發(fā)現(xiàn)了LZ-8具有多種達到臨床治療價值的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性。雖然LZ-8具有藥用價值，但其被開發(fā)成為新藥仍不被看好，主要原因是分子量小，僅13kDa，極容易被機體代謝，體內(nèi)穩(wěn)定性差，難以發(fā)揮其生物學(xué)作用。此外，LZ-8來源于靈芝，屬于異源蛋白，易引起機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生嚴重的排異反應(yīng)。考慮到以上問題，在本研究中將LZ-8與人IgG Fc段融合（LZ8-Fc）在畢赤酵母中進行重組表達，建立了中試發(fā)酵和純化工藝，初步研究了LZ8-Fc的體內(nèi)穩(wěn)定性和LZ-8的融合表達策略，本論文的實驗數(shù)據(jù)為融合蛋白表達共性問題中的不穩(wěn)定性因素提供了理論基礎(chǔ)，將對其長效劑型的開發(fā)具有一定的參考意義。 本研究中使用GGSS柔性肽段連接rLZ8和人IgG1中的Fc段，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性重新設(shè)計基因序列，兩端設(shè)EcoRI（GAATTC）和KpnI（GGTACC）酶切位點，進行全基因合成。將目的基因片段連接至AOX1型啟動子的甲醇誘導(dǎo)分泌型表達載體—pPICZɑ A，重組后的質(zhì)粒命名為pPICZɑ A-LZ8-Fc。重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母菌株X33，在搖瓶規(guī)模進行轉(zhuǎn)化克隆的表達篩選，并初步優(yōu)化了甲醇誘導(dǎo)表達條件。 在40升中試發(fā)酵規(guī)模下，通過摸索發(fā)酵過程工藝參數(shù)，包括pH值、DO值、罐壓、溫度、通氣量，優(yōu)化LZ8-Fc重組蛋白的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵工藝；發(fā)酵液上清SDS-PAGE電泳和Western Blot鑒定結(jié)果均顯示，從甲醇誘導(dǎo)表達階段，開始有目的蛋白條帶，至發(fā)酵后期出現(xiàn)了降解的LZ-8蛋白條帶。LZ8-Fc融合蛋白發(fā)酵上清經(jīng)過兩步切向流過濾處理，將樣品經(jīng)MabSelect Sure親和層析和Superdex75凝膠過濾層析進行純化，確定其穩(wěn)定的純化工藝，獲得了純度較高的LZ8-Fc融合蛋白，電泳顯示為單一條帶，質(zhì)譜分析結(jié)果與預(yù)期一致。但是Western Blot結(jié)果表明LZ8-Fc融合蛋白在純化過程中發(fā)生了降解。經(jīng)檢測，LZ8-Fc融合蛋白濃度為248g/mL，高效液相色譜的分子篩鑒定，LZ8-Fc融合蛋白的純度為98.33%。 采用綿羊血紅細胞凝集實驗鑒定發(fā)現(xiàn)與相同摩爾質(zhì)量的LZ-8蛋白比較，LZ8-Fc凝血活性降低。小鼠脾細胞的γ干擾素活性實驗顯示，LZ8-Fc未表現(xiàn)出LZ-8刺激脾細胞產(chǎn)生γ-干擾素的免疫調(diào)節(jié)活性。半衰期檢測采用大鼠尾靜脈給藥的方法，按照5min，30min，1h，2h，4h，8h，24h，48h八個時間點取血，結(jié)果表明血清中LZ8在8h內(nèi)明顯下降，24h后超出檢測范圍，LZ8-Fc融合蛋白在4h后超出檢測范圍。 根據(jù)SCOP網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫中的信息表明，LZ-8和IgG Fc段的晶體結(jié)構(gòu)均為球蛋白，因而我們利用分子篩為原理的HPLC分析LZ8-Fc在自然狀態(tài)下的保留時間，進而推斷出LZ8-Fc的分子組裝方式，實驗結(jié)果顯示LZ8-Fc仍以二聚體形式進行組裝的。本研究中還發(fā)現(xiàn)一個重要的實驗現(xiàn)象，即將LZ8-Fc濃縮至濃度（2.5mg/mL）時，LZ8-Fc分子出現(xiàn)了斷裂。本研究中采用分子動力學(xué)計算分析LZ8-Fc分子的穩(wěn)定性，并結(jié)合圓二色光譜結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)融合表達后分子的二級結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了很大變化，這可能是影響LZ-8分子穩(wěn)定性的主要原因。 本研究為增強LZ-8的體內(nèi)穩(wěn)定性，降低其作為異源蛋白的免疫原性進行了初步探索。雖然LZ8-Fc分子仍不夠穩(wěn)定，但本論文的實驗數(shù)據(jù)表明在融合蛋白表達后的應(yīng)用中普遍存在的一個重要的問題，即位于N末端的蛋白可能會影響下游蛋白質(zhì)的正確折疊。因此，融合表達中應(yīng)盡量保留下游蛋白原有的N末端，為其他在融合蛋白表達的設(shè)計上提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R3411;R283.6
【部分圖文】：

noderma lucidum）自古以來為我國吉祥如意的象征（圖壯、扶正固本的名貴藥材，其為中醫(yī)所用已有 2000 年之分豐富，我國古代早就對靈芝的藥用價值有所認識，根據(jù)農(nóng)本草經(jīng)》的記載，靈芝被列為“上品”，系指養(yǎng)生之藥且無副作用。近年來有文獻報道從靈芝中分離了一些蛋，并對它們的功能進行了研究。如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降作用等[1-5]。真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白（Fungal Immunomodulato靈芝中獲得的一種低分子蛋白質(zhì)，它們的功能與結(jié)構(gòu)在其它高等擔(dān)子菌中相繼發(fā)現(xiàn)了幾種類似的蛋白質(zhì)，共質(zhì)家族—FIPs[6]。FIPs 具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)特性，如促胞凋亡，調(diào)控細胞周期，影響細胞因子的表達及活化粘物研究開發(fā)潛力。

疫調(diào)節(jié)蛋白（Lingzhi-8, LZ-8），由于該蛋白具有多種免疫十多年以來一直是本領(lǐng)域研究的熱點，是 FIPs 蛋白家族近年從高等擔(dān)子菌（蘑菇類）子實體中提取，與免疫球蛋的一類小分子蛋白質(zhì)[8]。目前已經(jīng)從赤靈芝（Ganodermanoderma japoncium）[9]，松杉靈芝（Ganoderma tsugae）derma microsporum）[11]，金針菇（Flammulina velutipa volvacea）[12,13]分離提取了 7 種 FIPs 蛋白，分別命名為 Li，F(xiàn)IP-fve，F(xiàn)IP-vvo 和 FIP-vvl。這 7 種 FIPs 蛋白由 11，不含組氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（M（Asp）和纈氨酸（Val），其 N 端氨基酸均為乙�；钄嗑哂休^高同源性（圖 1.1.2），約為 57%-100%[14,15]，它們，來源于赤靈芝的 LZ-8 和松杉靈芝的 FIP-gts 其氨基酸序

1.2 LZ-8 的特征Tanaka 等采用兩相色譜系統(tǒng)、凝膠過濾及離子交換方法對 LZ-8 進行了純化，蛋白質(zhì)測序顯示 LZ-8 由 110 個氨基酸殘基組成，具有 2 個 α 螺旋、7 個 β-折疊和 1 個 β-轉(zhuǎn)角，氨基端乙�；�。分子量為 12.4kD ，等電點為 4.4[8]。1991 年，Tanaka 等采用混合寡核苷酸探針技術(shù)，從靈芝菌絲體 cDNA 文庫中克隆了 LZ-8核苷酸序列，證實了由該核苷酸編碼序列推導(dǎo)的氨基酸序列與所獲 LZ-8 氨基酸序列。（圖 1.1.3）LZ-8 基因由 524 bp DNA 組成，基因組序列上游轉(zhuǎn)錄起始區(qū)含有 1 個 TATA-box 和 2 個 CCAAT 樣序列。其 5’端非轉(zhuǎn)譯區(qū)含有 1 個 61bp 的內(nèi)含子，把該基因分成 2 個外顯子[9]。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 李和軍;張家永;李頻;鄭祥雄;周小玲;;人CD40-IgG1Fc段融合蛋白對EBV轉(zhuǎn)化的B細胞凋亡的影響[J];免疫學(xué)雜志;2009年03期

2 王磊;何劍;肖衛(wèi)華;;人干擾素α2b和IgG Fc片段融合蛋白顯著延長體內(nèi)半衰期[J];生物工程學(xué)報;2008年01期

3 梁重陽;張淑芹;劉志屹;孫非;;靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(Lz-8)在畢赤酵母中的表達及其免疫活性鑒定(英文)[J];生物工程學(xué)報;2009年03期

4 楊建軍;張昕l

本文編號：2825610