【摘要】：細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP),主要存在于肝微粒體中,在外源性化合物的生物轉(zhuǎn)化中起著十分重要的作用,參與臨床上約80%常用藥物的代謝。CYP酶系主要有CYP1、CYP2和CYP3三個家族,相比而言,比較重要的包括以下10種CYP亞型:CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4和CYP3A5。CYP催化反應(yīng)是體內(nèi)藥物代謝的關(guān)鍵步驟,而影響藥物在體內(nèi)的藥動學(xué)變化的根本原因是參與代謝的CYP酶的含量和活性存在較大個體差異。隨著蛋白定量技術(shù)的迅速發(fā)展,穩(wěn)定同位素稀釋內(nèi)標(biāo)-多反應(yīng)監(jiān)測-質(zhì)譜技術(shù)(SID-MRM-MS)因其特有的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性已成為較理想的蛋白定量方法。然而,目前對CYP含量和活性的研究僅限于其在肝微粒體中的含量及活性。盡管肝微粒體作為一種傳統(tǒng)的研究CYP酶的體系被廣泛沿用,但是為了客觀反映肝臟的真實(shí)狀態(tài),準(zhǔn)確地預(yù)測體內(nèi)的實(shí)際情況,有必要對肝臟從微觀到宏觀多水平的生理參數(shù)進(jìn)行分析和討論。因此確定10種CYP亞型在微粒體、肝組織、肝臟中的含量以及在酶水平、微粒體水平、肝組織水平和肝臟水平的活性,并研究同一水平10種CYP亞型的含量與活性的相關(guān)性,不同水平同種CYP亞型的含量間及活性間的相關(guān)性,以期為臨床上個體化合理用藥提供重要的生理值參考。方法1肝臟標(biāo)本收集正常人肝標(biāo)本90例,男性34例,女性56例,年齡在20~75歲之間,飲酒12例,抽煙12例。2人肝微粒體蛋白濃度的測定采用低溫差速離心法制備人肝微粒體,Bradford法測定人肝微粒體蛋白濃度。3微粒體中CYP含量與活性的測定穩(wěn)定同位素稀釋內(nèi)標(biāo)-多反應(yīng)監(jiān)測-質(zhì)譜技術(shù)測定人肝微粒體中10種CYP的含量,選用10種CYP的體外探針?biāo)幬餃y定其相應(yīng)的酶活性。4酶水平CYP活性的測定酶水平CYP的活性=微粒體水平CYP的活性/微粒體中CYP亞型的含量5肝組織水平CYP含量與活性的測定肝組織中CYP含量=微粒體中CYP含量×每克肝臟中微粒體蛋白含量(MPPGL)肝組織中CYP活性=微粒體中CYP活性×MPPGL6肝臟水平CYP含量與活性的預(yù)測肝臟中CYP含量=肝組織中CYP含量×肝重比(LW/BW)肝臟中CYP活性=肝組織中CYP活性×(LW/BW)7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用GraphPad Prism 5.0作圖軟件作圖。因本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)大部分不符合正態(tài)分布,故采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。結(jié)果1正常人肝中10種CYP的蛋白含量90例正常人肝標(biāo)本中10種CYP的蛋白含量符合非正態(tài)分布。在微粒體中,CYP2E1的蛋白含量最高,中位數(shù)為101.84 pmol/mg protein,范圍為11.49-166.20pmol/mg protein。含量最低的為CYP2B6,中位數(shù)為4.54 pmol/mg protein,范圍為1.68-46.19 pmol/mg protein。在肝組織中,CYP2C9的蛋白含量最高,中位數(shù)為3.67 nmol/g liver,范圍為0.41-21.72 nmol/g liver。含量最低的為CYP2B6,中位數(shù)為0.21 nmol/g liver,范圍為0.04-2.89 nmol/g liver。與肝組織中類似,在肝臟中,CYP2C9的蛋白含量最高,中位數(shù)為77.85 nmol/kg,范圍為9.37-440.88nmol/kg。含量最低的為CYP2B6,中位數(shù)為4.75 nmol/kg,范圍為0.75-60.49nmol/kg。2正常人肝中10種CYP的活性90例正常人肝標(biāo)本中10種CYP的K_m、V_(max)和CL_(int)均符合非正態(tài)分布。10種CYP亞型的K_m個體差異較小,均在40倍以下。10種CYP的V_(max)在酶水平、微粒體水平、肝組織水平和肝臟水平的變化各有不同。除CYP1A2、CYP2A6和CYP2C8隨著研究體系的擴(kuò)大個體差異程度呈上升趨勢以外,其他CYP的個體差異程度從酶水平到微粒體水平均先減小,而后又增大,并且肝組織水平和肝臟水平的結(jié)果相近。與V_(max)類似,10種CYP的CL_(int)在酶水平、微粒體水平、肝組織水平和肝臟水平的變化也不盡相同。隨著研究體系的擴(kuò)大,CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4、CYP3A5的個體差異程度先減小后增大;CYP2A6與CYP2D6的個體差異程度先增大后減小;CYP2C8與CYP2C19的個體差異程度一直增大,且肝組織水平和肝臟水平接近。3 10種CYP含量與活性的相關(guān)性基于微粒體水平、肝組織水平和肝臟水平分別對10種CYP的含量及其對應(yīng)的活性進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析。3.1微粒體水平CYP1A2的蛋白含量與其K_m無相關(guān)性(P0.05),但與其V_(max)和CL_(int)具有顯著相關(guān)性(P0.05)。CYP2D6的蛋白含量與其K_m呈負(fù)相關(guān)(P0.05),與其對應(yīng)的CL_(int)呈弱相關(guān),但與其對應(yīng)的V_(max)無相關(guān)性。CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4的蛋白含量與其對應(yīng)的微粒體水平活性均無相關(guān)性。其余CYP的含量與其活性均有不同程度的相關(guān)性。3.2肝組織水平除CYP2B6以外,其他酶亞型的蛋白含量和其對應(yīng)的活性均有顯著相關(guān)性(P0.05)。并且CYP1A2和CYP2E1的含量和其對應(yīng)的V_(max)和CL_(int)有較強(qiáng)的相關(guān)性(r0.60,P0.05)。CYP2C19、CYP3A4和CYP3A5的含量和其對應(yīng)的V_(max)和CL_(int)有較弱的相關(guān)性(0.50r0.60,P0.05)。CYP2D6的蛋白含量和CYP2D6的V_(max)和CL_(int)呈弱相關(guān)(0.40r0.60,P0.05)。3.3肝臟水平除CYP2B6以外,其他各酶亞型的蛋白含量與其對應(yīng)的V_(max)和CL_(int)均有顯著相關(guān)性(P0.05)。CYP1A2和CYP2E1的蛋白含量與其對應(yīng)的活性具有較強(qiáng)的相關(guān)性(r0.60,P0.05)。CYP2C19、CYP3A4和CYP3A5的蛋白含量與其對應(yīng)的V_(max)和CL_(int)相關(guān)性較弱(0.50r0.60,P0.05)。4 10種CYP蛋白含量的相關(guān)性4.1微粒體水平CYP1A2的蛋白含量與CYP2B6、CYP2C19的蛋白含量均無相關(guān)性(P0.05),與其他酶蛋白含量有顯著相關(guān)性(P0.01)。CYP2B6的蛋白含量與其他任何酶蛋白含量之間均無相關(guān)性。CYP2D6的蛋白含量除與CYP2B6的蛋白含量無相關(guān)性外,與其他酶含量都有顯著相關(guān)性(P0.01)。CYP3A5的蛋白含量與CYP2B6、CYP2C19的蛋白含量無相關(guān)性,與其他酶含量都有顯著相關(guān)性。4.2肝組織水平CYP1A2的蛋白含量與其他所有酶的蛋白含量均有顯著相關(guān)性(P0.05),并且與CYP2C8、CYP2C9、CYP2E1的蛋白含量的相關(guān)性較強(qiáng)(P0.01)。CYP2C9的蛋白含量與其他所有酶的蛋白含量均有顯著相關(guān)性,并且與CYP1A2、CYP2C8、CYP2E1的蛋白含量的相關(guān)性較強(qiáng)(P0.01)。除CYP2C19的蛋白含量與CYP3A5的蛋白含量無相關(guān)性(P0.05)外,CYP2E1、CYP3A5的蛋白含量均與其他所有CYP的蛋白含量有顯著相關(guān)性。4.3肝臟水平除了CYP2B6的蛋白含量與CYP2C19、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C19的蛋白含量無相關(guān)性(P0.05)以外,其他酶含量均有顯著相關(guān)性(P0.01)。4.4微粒體水平、肝組織水平與肝臟水平Spearman相關(guān)性分析分析90例正常人肝10種CYP的蛋白含量在微粒體水平、肝組織水平與肝臟水平之間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)同一種CYP亞型蛋白含量在微粒體水平、肝組織水平、肝臟水平之間均有顯著相關(guān)性(P0.05)。5 10種CYP活性的相關(guān)性5.1酶水平CYP1A2的V_(max)與CYP2B6、CYP2C19、CYP3A4的V_(max)無相關(guān)性(P0.05),與其他CYP的V_(max)均有顯著相關(guān)性(P0.05)。CYP2C8的V_(max)與CYP2C19的V_(max)無相關(guān)性,與其他CYP的V_(max)均有顯著相關(guān)性。CYP2C19的V_(max)只與CYP2A6有相關(guān)性。CYP3A5的V_(max)與CYP3A4的V_(max)的相關(guān)性最強(qiáng)。CYP2C19的CL_(int)與CYP2C9的CL_(int)有顯著相關(guān)性(P0.05),與其他酶的CL_(int)均無相關(guān)性(P0.05)。CYP2D6、CYP2E1的CL_(int)除與CYP2C19的CL_(int)無相關(guān)性外,與其他酶的CL_(int)均有顯著相關(guān)性。5.2微粒體水平CYP2A6的V_(max)只與CYP2C19的V_(max)有顯著相關(guān)性(P0.05),與其他CYP的V_(max)均無相關(guān)性(P0.05)。CYPC8的V_(max)與CYP2A6、CYP2E1的V_(max)無相關(guān)性,與其他CYP的V_(max)有較強(qiáng)相關(guān)性(P0.01)。CYP2E1的V_(max)與CYP2C9、CYP2C19的V_(max)有顯著相關(guān)性。CYP2A6的CL_(int)與其他所有CYP的CL_(int)無相關(guān)性(P0.05)。CYP2D6的CL_(int)只與CYP2B6的CL_(int)有相關(guān)性(P0.05)。CYP2C19的CL_(int)只與CYP3A4的CL_(int)有顯著相關(guān)性(P0.01)。CYP2E1的CL_(int)只與CYP1A2、CYP2C19的CL_(int)有相關(guān)性。5.3肝組織水平CYP2B6的V_(max)只與CYP2A6的V_(max)無相關(guān)性(P0.05),與其他CYP的V_(max)均有顯著相關(guān)性(P0.05)。CYP2D6的V_(max)與CYP2A6的V_(max)無相關(guān)性,與其他CYP呈弱相關(guān)。10種CYP的CL_(int)均有顯著相關(guān)性。5.4肝臟水平CYP2A6的V_(max)與CYP2B6、CYP2D6的V_(max)無相關(guān)性(P0.05),其余各酶之間V_(max)均有顯著相關(guān)性(P0.05)。CYP2C9的V_(max)與CYP2E1的V_(max)有較強(qiáng)相關(guān)性。10種CYP的CL_(int)均有顯著相關(guān)性。5.5酶水平、微粒體水平、肝組織水平與肝臟水平Spearman相關(guān)性分析10種CYP的活性在酶水平、微粒體水平、肝組織水平與肝臟水平之間的相關(guān)性。在酶水平與微粒體水平之間,除CYP2C19與CYP3A5的V_(max)在兩個水平之間無相關(guān)性外(P0.05),其他CYP的V_(max)在兩個水平之間均有相關(guān)性(P0.05)。除CYP2A6與CYP2C19的CL_(int)在兩個水平之間無相關(guān)性外,其他CYP的CL_(int)在兩個水平之間均有相關(guān)性。在酶水平與肝組織水平之間,除CYP2C9、CYP2C19與CYP3A5的V_(max)在兩個水平之間無相關(guān)性外(P0.05),其他CYP的V_(max)在兩個水平之間均有相關(guān)性(P0.05)。除CYP2A6、CYP2C19與CYP3A5的CL_(int)在兩個水平之間無相關(guān)性外,其他CYP的CL_(int)在兩個水平之間均有相關(guān)性。在酶水平與肝臟水平之間,除CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19與CYP3A5的V_(max)在兩個水平之間無相關(guān)性外(P0.05),其他CYP的V_(max)在兩個水平之間均有相關(guān)性(P0.05)。除CYP2A6與CYP2C19的CL_(int)在兩個水平之間無相關(guān)性外,其他CYP的CL_(int)在兩個水平之間均有相關(guān)性。在微粒體水平與肝組織水平之間以及微粒體水平與肝臟水平之間,所有CYP的V_(max)和CL_(int)在兩個水平之間均有顯著相關(guān)性(P0.05)。在肝組織水平與肝臟水平之間,所有CYP的V_(max)和CL_(int)在兩個水平之間均有很強(qiáng)的相關(guān)性(r0.90,P0.05)。結(jié)論1.首次提供了正常人肝10種CYP在微粒體水平、肝組織水平和肝臟水平蛋白含量的生理值,各水平均有顯著的個體差異。2.在微粒體水平,CYP2A6的蛋白含量對其活性的影響較明顯;但在任一水平,CYP2B6的蛋白含量對其活性均無影響。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R341

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;CYP2E1 Pst Ⅰ/Rsa Ⅰ polymorphism and colorectal cancer risk:A meta-analysis[J];World Journal of Gastroenterology;2010年23期

本文編號：2822784