金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是自然界中廣泛存在的一種重要的病原菌,可引起許多嚴(yán)重感染,屬于革蘭氏陽性菌。環(huán)二腺嘌呤核苷酸(c-di-AMP)是革蘭氏陽性菌中廣泛存在的第二信使分子,對于細(xì)菌胞內(nèi)鉀離子運輸,脂肪酸合成,細(xì)胞壁的穩(wěn)態(tài)及生物被膜的形成等都具有重要的調(diào)控作用。細(xì)菌胞內(nèi)c-di-AMP的合成和降解分別受二腺苷酸環(huán)化酶(diadenylate cyclase,DAC)及磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)的調(diào)控。目前已知的降解c-di-AMP的磷酸二酯酶根據(jù)結(jié)構(gòu)域可分為兩類:(1)DHH-DHHA1結(jié)構(gòu)域蛋白,包括GdpP及其同源蛋白以及Rv2837c類獨立的DHH-DHHA1單結(jié)構(gòu)域蛋白。(2)HD類催化結(jié)構(gòu)域蛋白,其中GdpP類以及HD類PDE可將c-di-AMP降解成pApA,而只有Rv2837c類PDE可繼續(xù)降解pApA為AMP。本論文主要內(nèi)容為金黃色葡萄球菌中參與降解c-di-AMP的磷酸二酯酶GdpP的蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究。GdpP是第一類被鑒定出的能降解c-di-AMP的磷酸二酯酶,存在于多種革蘭氏陽性菌中,在敲除GdpP的菌株中能檢測到胞內(nèi)c-di-AMP水平的顯著增加。GdpP N端具有兩個穿膜區(qū),隨后是一個PAS(Per-Arnt-Sim)結(jié)構(gòu)域和一個退化的GGDEF結(jié)構(gòu)域,C端為DHH-DHHA1催化結(jié)構(gòu)域。GdpP能降解c-di-AMP和c-di-GMP生成pApA和pGpG,但是GdpP降解c-di-GMP的速率非常低。我們對GdpP全長,以及C端DHH-DHHA1結(jié)構(gòu)域分別進(jìn)行了蛋白表達(dá)純化及結(jié)晶,最終獲得了分辨率為2.2 A的C端DHH-DHHA1結(jié)構(gòu)域(GdpP-C)蛋白晶體,通過X-射線衍射晶體學(xué)解析得到GdpP-C的蛋白結(jié)構(gòu)。分析發(fā)現(xiàn)GdpP-C的結(jié)構(gòu)與已知的DHH-DHHA1結(jié)構(gòu)非常相似,都包含保守的DHH與DHHA1結(jié)構(gòu)基序,兩個結(jié)構(gòu)域之間由一段柔性loop相連。DHH結(jié)構(gòu)域包含一個由兩個錳離子組成的酶活中心,同時與Rv2837c結(jié)構(gòu)相比,參與雙錳配位的氨基酸是高度保守的,表明GdpP-C具有相同的雙錳降解機制。為了進(jìn)一步闡明GdpP的催化水解機制,我們利用小分子浸泡晶體的實驗方法得到了 GdpP-C蛋白與小分子c-di-AMP、c-di-GMP以及5'-pApA的三種復(fù)合物結(jié)構(gòu)。復(fù)合物結(jié)構(gòu)的分辨率分別為2.15 A、2.2 A和2.6 A。通過對GdpP-C以及三種復(fù)合物結(jié)構(gòu)的比較分析,可以得出三種小分子以相同的伸展方向結(jié)合在GdpP-C的DHHA1結(jié)構(gòu)域的相同位置,表明DHHA1結(jié)構(gòu)域為底物識別結(jié)構(gòu)域,但小分子的磷酸二酯鍵都遠(yuǎn)離位于DHH結(jié)構(gòu)域的雙錳活性中心,只有當(dāng)中間的柔性loop區(qū)發(fā)生構(gòu)象變化使DHH與DHHA1足夠靠近時才可能發(fā)生降解反應(yīng)。我們以之前實驗室解析的活性狀態(tài)的Rv2837c結(jié)構(gòu)為模型模擬了活性狀態(tài)下的GdpP-C的結(jié)構(gòu),在活性狀態(tài)下三種小分子與DHHA1的結(jié)合沒有發(fā)生變化,并且通過突變體酶活實驗進(jìn)一步證明了活性結(jié)構(gòu)的可靠性。復(fù)合物結(jié)構(gòu)充分展示了GdpP-C在降解底物過程中的底物結(jié)合以及產(chǎn)物生成的方式。結(jié)構(gòu)分析顯示GdpP-C結(jié)合底物的方式與Rv2837c有很大不同,鑒于之前我們實驗室只拿到了Rv2837c降解c-di-AMP第二步反應(yīng)的底物結(jié)合方式,因此我們大膽猜測GdpP-C的底物結(jié)合方式同樣代表了 Rv2837c第一步降解過程的底物結(jié)合方式。我們將DHH-DHHA1蛋白的底物結(jié)合位點分為三個亞位點并分別命名為R,C和G。GdpP-C在其C和G位點上水解c-di-AMP生成pApA,而在Rv2837c中pApA可以繼續(xù)翻轉(zhuǎn)到C和R位點并進(jìn)一步降解為AMP。通過突變體酶活實驗證明,擴大GdpP-C的C位點和R位點可以使GdpP-C具有進(jìn)一步降解pApA的能力,同時突變Rv2837c的G位點和R位點的關(guān)鍵氨基酸可以分別阻礙c-di-AMP第一步與第二步的降解反應(yīng)。此外我們還發(fā)現(xiàn)C位點決定了 DHH-DHHA1特異性識別底物核苷酸的能力。結(jié)構(gòu)分析及酶活驗證揭示了 DHH-DHHA1蛋白家族具有統(tǒng)一的催化機制。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R378
【部分圖文】：

但是不含功能性的ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ合成的酶［３５］。逡逑在生物體內(nèi)ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ是由一種叫做二腺苷酸環(huán)化酶（ＤＡＣ）的蛋白質(zhì)以ＡＴＰ逡逑或ＡＤＰ作為底物合成的（圖１－１）。該種酶是一種具有環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，逡逑它催化兩分子ＡＴＰ或ＡＤＰ通過縮合反應(yīng)，最后合成一分子的ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ［３５］。ＤＡＣ逡逑結(jié)構(gòu)域是在研宄一種可以被用來觀察染色體的病變的蛋白－ＤｉｓＡ的Ｘ射線晶體逡逑結(jié)構(gòu)的研宄中被發(fā)現(xiàn)的［３６］。后來，在許多細(xì)菌和古細(xì)菌物種中發(fā)現(xiàn)含有ＤＡＣ結(jié)￥逡逑構(gòu)域的蛋白質(zhì)。ＤｉｓＡ，邋ＣｄａＡ，邋ＣｄａＭ和ＣｄａＳ是迄今為止己經(jīng)確定了的四類ＤＡＣ逡逑結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)。一般情況下一種生物僅含有一種類型的ＤＡＣ，但也有一些含有逡逑多種酶，例如梭菌屬（Ｃ／ｏｓｆｒ砂ｗｗｓｐｐ），含有兩種類型的ＤＡＣ邋（ＣｄａＡ和ＤｉｓＡ）逡逑以及枯草芽孢桿菌含有三種ＤＡＣ邋（ＤｉｓＡ，邋ＣｄａＳ和ＣｄａＡ）邋［３６３７】。逡逑所有的ＤＡＣ結(jié)構(gòu)域蛋白都含有保守的氨基酸序列，相鄰基因與各類ＤＡＣ逡逑的協(xié)同作用

ＧｄｐＰ是一個掛膜蛋白，為了進(jìn)一步了解跨膜區(qū)位置（便于后繼改造），逡逑我們用跨膜蛋白的預(yù)測網(wǎng)站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ－２．０）對該逡逑蛋白進(jìn)行了跨膜區(qū)域預(yù)測，其結(jié)果如圖２－２所示：我們從預(yù)測結(jié)果可以看到，該逡逑蛋白的前５４個氨基酸是跨膜區(qū)域

我們?yōu)椋M(jìn)一步對載體進(jìn)行構(gòu)建，還使用ＤＮＡｓｔａｒ中的Ｐｒｏｔｅａｎ對ＧｄｐＰ疏水性進(jìn)行了分析，其結(jié)果如圖２－３所示，最下邊一行為疏水性的分析，域在上邊的位置是親水性區(qū)域，黃色區(qū)域在下邊的是疏水性區(qū)域，分析我發(fā)現(xiàn)該蛋白的Ｎ端具有較強的親水性，所以在載體構(gòu)建的過程中，盡量Ｎ端Ｔａｇ標(biāo)簽的載體。逡逑１邋Ｔ邋－邋｜邋■邋Ｉ邋＇邋Ｉ邋｜邋■邋，邋，邋邋邋｜邋，邋１邋｜邐！邋■邋Ｉ邋■邋｜逡逑Ｉ邋ｒ邋？－＊邋＊ｃ邋ａ邋＇Ｘ邋ｒ．邋－ｖ邋ｚ邋７ｒ．邋７ｉ邋＇ｆｔ邋ｘａ邋ｋ邋ｔｔ邋ｖ：邋ａ邋0邋＾邋ｍ邋ｖ：邋７．邋ｖ．邋ｎ邋％邐％逡逑＊＾魯曷１１—１１＿邋？邐？邋—＾暑馨■（■軎？灥邋４ＭＩ邋州如：分逡逑＊１－邋Ｉ邋￣邋x哄巍觥鰣澹櫻停灣�？■�8暴１邋灥－．１■

本文編號：2820710