噬菌體天然抗體庫通常具有庫容大、多樣性好的優(yōu)勢,可廣泛用于人源靶點治療及診斷抗體篩選。但由于天然抗體庫中抗體序列多來自IgM,未經刺激成熟,體內親和力較IgG型偏弱。將獲得的scFv序列組裝至IgG全長后,親和力通常為10~(-7)至10~(-8) M級,難以滿足對親和力要求較高時的需求。本論文通過針對不同的靶點的結構特征、項目需求進行抗體淘選和篩選實驗。首先,抗原分別選取細胞表面胞外區(qū)蛋白、多跨膜蛋白、人源抗原和鼠源抗原,進行直接法和間接法Elisa實驗,優(yōu)化抗體的檢測方法。其次,淘選階段選取不同的結合形式,分別選取固相篩選、液相篩選、細胞篩選和高通量儀器進行淘選,并選取不同的抗原篩選起始濃度,對比Output抗體序列的數量和陽性率,優(yōu)化淘選方法。其三,在篩選階段通過優(yōu)化Elisa形式、緩沖液類型和試劑濃度等方式,增加抗原與噬菌體顆粒之間的檢測窗口,提高陽性數值,減少假陽性。通過這一系列的優(yōu)化手段,最終獲得多個滿足需求的高親和力抗體(10~(-9)至10~-1010 M)。這些淘選和篩選方法的優(yōu)化研究,有利于提高最終抗體的陽性率和多樣性,為利用噬菌體展示抗體庫高通量篩選獲得目標抗體提供了方法學上的參考。
【學位單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

絲狀噬菌體復制過程和結構圖

體的兩邊基因為線形、雙鏈開鏈結構，其末端帶有 12 個左單鏈 DNA 構成[7,10,11]。T4 噬菌體展示系統也是一種較為系統[12]。它的主要特點是衣殼蛋 S℃和 H℃的 C 端中能夠白分別融合，從而展示于 T4 噬菌體的表面，故而蛋白純會因為復雜的純化手段而導致蛋白失活和變性。T7 噬菌體于其他體系，發(fā)展的較晚。T7 展示系統的衣殼蛋白有 10A式，一般會情況下會采用 10B 衣殼蛋作為表達和融合外源。T7 噬菌體的一個主要特點是生長周期比較快，節(jié)省了時蛋白大小范圍廣，可多表達 50 多個氨基酸的多肽片段，酸的蛋白。T7 噬菌體整體的耐受性較強，耐酸、耐堿、件下較為穩(wěn)定，非常利于篩選不同條件下和環(huán)境下的目標本身活性。

上海交通大學碩士學位論文的表達水平，HuCAL-PANTINUM 的總庫容達到 4.5×1010,正確率超過 70文獻報道的庫容最大，正確率最高的抗體庫。混合庫是指將分別構建的各類抗體庫（包括天然抗體庫，合成抗體成抗體庫）中的 2- 3 種不同的類型的各類子庫混合在一起構建而成的新型混合庫的有點，有天然庫及半合成抗體庫的特點，提高抗體庫的多樣性用性。理論上篩到各種抗原結合的特異性抗體。

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本文編號：2820379