目的創(chuàng)建新的小鼠急性感染-潛伏-復(fù)發(fā)感染模型,為結(jié)核病多病程的機(jī)制研究、診斷以及抗結(jié)核藥藥效學(xué)評(píng)價(jià)研究提供基礎(chǔ)。方法結(jié)核菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv菌液106CFU經(jīng)尾靜脈感染C57BL/6雌性小鼠,兩周之后給予異煙肼(1Omg/kg)連續(xù)治療四周,治療停藥后開始注射TNF-α抗體(50ug/只),每周一次,連續(xù)四周。分別在感染兩周、異煙肼治療四周以及TNF-α抗體誘導(dǎo)四周后解剖小鼠,通過(guò)對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的肺、脾和肝組織荷菌量及病理病變的定量分析,來(lái)最終評(píng)價(jià)新的多病程結(jié)核動(dòng)物模型建立是否成功。結(jié)果小鼠感染H37Rv后,感染第2周,肺臟、脾臟、肝臟組織的荷菌量(LgCFU/mL)分別是2.46±0.38,4.66±0.24,4.31 ±0.07,感染后荷菌量明顯升高。感染2周時(shí),總體觀察無(wú)明顯病變,組織病理檢查顯示:肺臟內(nèi)可見數(shù)個(gè)肉芽腫,肉芽腫主要由巨噬細(xì)胞及較多淋巴細(xì)胞構(gòu)成,血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯;肝組織可見大量散在(每視野約20個(gè))的面積為2-10mm2的肉芽腫,肉芽腫主要由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及少數(shù)中性粒細(xì)胞構(gòu)成;脾臟白髓區(qū)及紅髓區(qū)被肉芽腫破壞,肉芽腫主要由巨噬細(xì)胞組成。異煙肼治療4周之后,治療組的肺、脾和肝荷菌量(LgCFU/mL)分別為:0,2.68±0.59,2.58±0.51,而此時(shí)感染對(duì)照組肺臟、脾臟、肝臟荷菌量分別為3.64±0.54,4.06±0.38,3.06±0.28。治療組無(wú)肉眼可見病理改變,組織病理結(jié)果顯示(10O×視野):肺組織除偶可見的血管旁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以外,肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁略增厚;肝組織中偶可見肉芽腫,面積約為0.5-5mm2,伴有輕微的干細(xì)胞水腫;脾組織偶見散在的不規(guī)則的細(xì)小肉芽腫。治療結(jié)束后停藥,四周后自然復(fù)發(fā)或者用TNF-α抗體誘導(dǎo)復(fù)發(fā),TNF-α抗體誘導(dǎo)組肺、脾、肝臟組織荷菌量(LgCFU/mL)為別為4.42±0.07,4.72±0.02,3.68±0.04。治療后自然復(fù)發(fā)組肺臟、脾臟、肝臟荷菌量分別是3.74±0.14,4.34±0.24,3.47±0.20;肺、脾臟病變百分比(%)分別為 4.11 ± 1.52,6.16±1.67,肝臟內(nèi)肉芽腫密度(number/mm2)為 1.25±0.42。TNF-α抗體誘導(dǎo)組相對(duì)于治療后自然復(fù)發(fā)組,各組織肉芽腫樣病變明顯加重。結(jié)論小鼠感染結(jié)核菌2周后,肺臟、脾臟和肝臟荷菌量及組織肉芽腫病變提示結(jié)核感染處于急性期。異煙肼治療4周之后,肺、脾、肝荷菌量較低且病變輕微,轉(zhuǎn)入潛伏期。TNF-α抗體誘導(dǎo)后荷菌量和病理病變明顯加重,提示潛伏感染后復(fù)發(fā),并且同組內(nèi)小鼠復(fù)發(fā)起點(diǎn)和復(fù)發(fā)水平較一致。因此,新的急性感染-潛伏-復(fù)發(fā)感染的多病程小鼠結(jié)核模型建立成功,整個(gè)模型的周期為10周,大大縮短了研究的時(shí)間,并且潛伏期、復(fù)發(fā)期荷菌量和病變參數(shù)穩(wěn)定,適合于結(jié)核機(jī)制研究和藥物疫苗的評(píng)價(jià)研究。目的利用功能性PD-L1(Programmed cell death ligand 1,PD-L1)單抗阻斷巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的PD1/PD-L1通路,研究其對(duì)于小鼠結(jié)核治療后復(fù)發(fā)的免疫干預(yù)作用和機(jī)制。方法106CFU H37Rv經(jīng)尾靜脈感染C57BL/6雌性小鼠獲得結(jié)核的急性感染,兩周之后分別給予異煙肼(10mg/kg)和異煙肼聯(lián)合PD-L1單抗(50ug/只)連續(xù)治療四周,獲得潛伏感染,在潛伏期用TNF-α抗體(50μg/只)誘導(dǎo)四周使其復(fù)發(fā)。通過(guò)對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的肺、脾和肝組織病理及荷菌量的定量分析,探討PD-L1單抗對(duì)小鼠活動(dòng)性結(jié)核及結(jié)核復(fù)發(fā)的干預(yù)作用。利用體外實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步闡明敲低PD-L1對(duì)結(jié)核菌感染的巨噬細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果小鼠感染后,前兩周肺、脾和肝荷菌量較高(3-4LgCFU/mL)、肉芽腫病變較重,表現(xiàn)為活動(dòng)性結(jié)核,異煙肼和異煙肼聯(lián)合PD-L1單抗分別治療四周之后,肺、脾和肝荷菌量均較模型對(duì)照組顯著性地降低,肉芽腫樣病變也顯著減輕,但是兩個(gè)治療組之間沒(méi)有顯著性的差異。而在復(fù)發(fā)期,相比較于異煙肼治療組,異煙肼聯(lián)合PD-L1單抗治療組能夠顯著降低復(fù)發(fā)期組織荷菌量,減輕病理病變。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí):用PD-L1抗體或siRNA敲低巨噬細(xì)胞上PD-L1,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者都能能促進(jìn)結(jié)核感染的巨噬細(xì)胞凋亡。結(jié)論功能性的PD-L1抗體可以抑制結(jié)核復(fù)發(fā),敲低巨噬細(xì)胞上PD-L1或阻斷PD1/PD-L1通路能促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡,提示阻斷PD-L1能夠有效的協(xié)助異煙肼治療結(jié)核病,并且顯著地抑制結(jié)核的復(fù)發(fā)。目的在多個(gè)遺傳多樣性小鼠品系中研宄結(jié)核對(duì)小鼠的易感性,進(jìn)一步在The Geneminer數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)遺傳多樣性小鼠的荷菌量以及病理病變定量分析,預(yù)測(cè)易感基因位點(diǎn)以及相應(yīng)的SNPs。方法以1×l0~6CFU結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv尾靜脈途徑感染四周齡雌性C57BL/6小鼠以及17個(gè)同性別同周齡遺傳多樣性小鼠品系,感染四周之后脫頸椎處死,取肺、脾、肝組織。通過(guò)量化評(píng)價(jià)病理病變和組織荷菌量來(lái)確定遺傳多樣性小鼠的易感性表型;利用The Geneminer數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)遺傳多樣性小鼠的荷菌量以及病理病變定量分析,預(yù)測(cè)易感基因位點(diǎn)以及相應(yīng)的SNPs。結(jié)果18個(gè)小鼠品系的荷菌量和病變呈現(xiàn)不同的值,其中荷菌量高的小鼠品系病變值可以較高也可以較低,病變值高的也與荷菌量不一定一致,具體結(jié)果為:肺、脾和肝臟的荷菌量值由低到高排序分別為:FEW♀,LAMA♂ DET3♂,LUS♂ BOM♀,LAT♂,PUB♀,NUK♀,SHE♂,TOP♀,ROGAN♂,PIPING♂,DAVIS♀,C57♀,BOON♀,LOT♀,SAT♂,BEM♂;DET3♂,SHE♂,BOM♀,C57♀,PUB♀,ROGAN♂,TOP♀,LUSA♂,FEW♀,NUIC♀,LAM♂,DAVIS♀,LAT♂,PIPING♂,SAT♂,BEM♂,LOT♀,BOON♀;LUS♂,SHE♂,PUB♀,TOP♀,BOM♀,DET3♂,FEW♀,DAVIS♀,C57♀,LAM♂,ROGAN♂,NUK♀,PIPING♂,BEM♂,SAT♂,BOON♀,LAT♂,LOT♀。用“MugaQTL(narmalise)”分析不同組織的荷菌量,發(fā)現(xiàn):肺臟、脾臟和肝臟的目標(biāo)基因分別位于第3號(hào),4號(hào)和3號(hào)染色體,其中臟中預(yù)測(cè)到143個(gè)目標(biāo)編碼的SNPs位點(diǎn),脾臟中預(yù)測(cè)264個(gè)目標(biāo)編碼的SNPs位點(diǎn),肝臟沒(méi)有預(yù)測(cè)到目標(biāo)編碼的SNPs位點(diǎn)。結(jié)論結(jié)核菌對(duì)不同小鼠品系的易感性不同,其中同一品系病變和荷菌量不一定保持易感性一致的關(guān)系,并且不同組織臟器的易感性也有差異,因此按照不同組織的荷菌量或者不同組織的病變進(jìn)行易感基因的分析。根據(jù)荷菌量值,利用Geneminer數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)肺和肝的易感基因在3號(hào)染色體上,脾的易感基因在4號(hào)染色體上。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R52;R-332
【部分圖文】：

肺臟、脾臟、肝臟荷菌量（ＬｇＣＦＵ／ｍＬ）分別為：３．６４±０．５４，邋４．０６±０．３８，３．０６土逡逑０．２８，相對(duì)于感染對(duì)照組，異煙胼治療４周的肺臟、脾臟、肝臟組織荷菌量顯著性降低逡逑（Ｐ＜０．００１，邋Ｐ＜０．０１，邋Ｐ＜０．０５）0逡逑異煙肼治療４周之后，不加ＴＮＦ－ａ抗體誘導(dǎo)組的肺臟、脾臟、肝臟的荷菌量分別逡逑為：３．７４±０．丨４，４．３４±０．２４，邋３．４７±０．２０。ＴＮＦ－ａ抗體誘導(dǎo)４周后，肺臟、脾臟、肝臟逡逑的荷菌量分別為：４．４２±０．０７，４．７２±０．０２，３．６８土０．０４。相對(duì)于感染對(duì)照組，不加ＴＮＦ－逡逑ａ抗體誘導(dǎo)組（圖丨－３－ＢＩＮＨ）和ＴＮＦ－ａ誘導(dǎo)組（圖丨－３－ＢＴＮＦ－ａ邋）脾臟的荷菌量增加，逡逑但只有ＴＮＦ－ａ誘導(dǎo)組的差異存在顯著性（Ｐ＜０．０５），而脾臟和肝臟的荷菌量還未達(dá)到感逡逑染對(duì)照組的水平。相較于不加ＴＮＦ－ａ抗體誘導(dǎo)組，ＴＮＦ－ａ誘導(dǎo)組的肺臟和脾臟荷菌量逡逑顯著性上升（Ｐ＜0．00ｌ，Ｐ＜0．0５），肝臟雖然也上升，但是差異不具顯著性。逡逑整個(gè)模型實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的荷菌量的動(dòng)態(tài)變化如圖所示（見圖１－３－Ｃ），感染對(duì)照組：肺逡逑臟在０－１０周荷菌量逐漸上升；脾臟在０－２周內(nèi)荷菌量上升，２－１０周荷菌量持續(xù)下降；肝逡逑臟荷菌量０－２周內(nèi)上升，２－６周下降，６－１０周又上升。異煙胼治療組感染后０－２周內(nèi)荷逡逑菌量與感染對(duì)照組趨勢(shì)一致，在２－６周，肺臟、脾臟和肝臟荷菌量下降，６－１０周，其中逡逑ＴＮＦ－ａ誘導(dǎo)組和無(wú)ＴＮＦ－ａ抗體誘導(dǎo)組的荷菌量都ｔ升，但是前者荷菌量增幅大于后者。逡逑１０0ｎＬ，１０７ＣＦＵ邋的異煙胼（１０ｍｇ／ｋｇ）治ＴＮＦ－ａ邋（５０｜ｉＬ／只）治逡逑

第二部分逡逑為１００Ｘ倍。脾、肝和肺組織中標(biāo)記處為病變逡逑圖２－３小鼠結(jié)核模型中肺脾肝不同時(shí)期的組織病理改變（ｎ邋＝邋４）逡逑Ｎｏｔｅ．邋Ｆｉｇｕｒｅｓ邋ｆｒｏｍ邋ｌｅｆｔ邋ｔｏ邋ｒｉｇｈｔ邋ｓｔａｎｄ邋ｆｏｒ邋ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｓｐｌｅｅｎ，邋ｌｉｖｅｒ邋ａｎｄ邋ｌｕｎｇ逡逑ｔｉｓｓｕｅｓ，邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ：邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｗａｓ邋ｘ邋１２．５邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｌａｒｇｅｒ邋ｐｉｃｔｕｒｅ，邋ｘ邋１２．５邋ｏｆ邋ｔｈｅ逡逑ｕｐｐｅｒ邋ｌｅｆｔ邋ｉｎｓｅｔｓ．邋Ｔｈｅ邋ｍａｒｋｅｒｓ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｓｐｌｅｅｎ，邋ｌｉｖｅｒ邋ａｎｄ邋ｌｕｎｇ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｐｉｃｔｕｒｅｓ邋ａｒｅ邋ｔｈｅ邋ｄｉｓｅａｓｅ邋ｌｅｓｉｏｎｓ．逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｌｕｎｇ，邋ｓｐｌｅｅｎ邋ａｎｄ邋ｌｉｖｅｒ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋Ｍ邋ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｍｉｃｅ逡逑３結(jié)核菌感染巨噬細(xì)胞后ＰＤ－Ｌ１的表達(dá)逡逑結(jié)核菌感染巨噬細(xì)胞２４小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，左圖（圖２－４－Ａ）為巨噬細(xì)胞陰逡逑性對(duì)照，右圖（圖２－４－Ｂ）為Ｈ３７Ｒｖ感染巨噬細(xì)胞２４小時(shí)的結(jié)果，紅色峰表示感染細(xì)逡逑胞ＰＤ－Ｌ１的表達(dá)，藍(lán)色峰表示未感染細(xì)胞ＰＤ－Ｌ１的表達(dá)。Ｈ３７Ｒｖ感染巨噬細(xì)胞２４ｈ后，逡逑紅色峰右移

圖３－８），其中肺臟組織荷菌量在３號(hào)染色體?

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 占玲俊;唐軍;秦川;;PD-1:PD-L1/PD-L2通路在結(jié)核感染中的免疫作用[J];中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志;2015年07期

2 林城;陳雄;劉靜南;黃于芳;歐陽(yáng)學(xué)農(nóng);;PD-1/PD-L1信號(hào)通路在非小細(xì)胞肺癌免疫逃逸及其治療中的研究進(jìn)展[J];中國(guó)肺癌雜志;2014年10期

3 江道斌;齊曼古力·吾守爾;;HLA基因多態(tài)性與結(jié)核病遺傳易感性關(guān)系的研究進(jìn)展[J];新疆醫(yī)學(xué);2013年04期

4 林樹柱;董娜;向志光;徐艷峰;占玲俊;馬春梅;秦川;;結(jié)核分枝桿菌低劑量感染小鼠模型的建立與分析[J];中國(guó)防癆雜志;2012年12期

5 王勝圣;周杰;張彥峰;王麗;馮瀟;李昊霖;周建民;;中醫(yī)藥治療復(fù)治肺結(jié)核的研究進(jìn)展[J];遼寧中醫(yī)雜志;2012年07期

6 向志光;林樹柱;董娜;袁偉;徐艷峰;秦川;;結(jié)核分枝桿菌感染小鼠的脾臟和肺臟組織荷菌量與病理變化[J];中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志;2011年08期

7 鄭梅琴;付雷;王彬;李們;陸宇;;豚鼠結(jié)核病模型在抗結(jié)核新藥評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J];臨床肺科雜志;2011年08期

8 張濤;呂純芳;盧留珠;劉守江;黃映東;趙錦;;BACTEC MGIT960系統(tǒng)快速培養(yǎng)分枝桿菌的效果評(píng)價(jià)[J];臨床肺科雜志;2011年05期

9 袁偉;秦川;;結(jié)核疫苗研究進(jìn)展[J];中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志;2011年02期

10 師長(zhǎng)宏;;結(jié)核桿菌潛伏感染小鼠模型的制備及其評(píng)價(jià)指標(biāo)[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào);2010年06期

本文編號(hào)：2820113