研究背景肝郁脾虛證是一種中醫(yī)常見證候,主要涉及肝和脾兩個臟腑,肝郁和脾虛互為因果。若情志不遂,肝主疏泄功能失常,出現(xiàn)肝木橫乘脾土;若飲食不節(jié)、勞倦傷脾,脾失健運則出現(xiàn)脾土反侮于肝木。由于肝脾兩臟在病理上相互影響傳變,在“肝失疏泄木乘脾土”和“脾失健運反侮于肝”這兩種不同病因?qū)е孪嗤C候的理論研究思路引導(dǎo)下,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中與情緒和飲食密切相關(guān)的腦-腸軸逐漸成為了肝郁脾虛證研究的一個熱點方向。腦腸肽是一類在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道表達的內(nèi)分泌信號分子,通過腦-腸軸參與攝食調(diào)節(jié)及能量平衡。血管活性腸肽(Vasoactive intestinal peptide,VIP)是一種廣泛分布于中樞與外周的腦腸肽,既可作為神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用,也可通過與其受體結(jié)合調(diào)節(jié)生理功能。VIP在調(diào)節(jié)胃腸道、應(yīng)激、調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶等方面均可發(fā)揮作用。在前期研究中已通過慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激方法成功復(fù)制肝郁脾虛證大鼠模型,并且發(fā)現(xiàn)在肝郁脾虛證模型大鼠中存在著腦腸肽異常表達的現(xiàn)象,可能是肝郁脾虛證腦腸互動異常的機制之一。但VIP及其受體的表達是否與肝郁脾虛證腦腸互動異常有關(guān),是否是肝郁脾虛證模型大鼠出現(xiàn)相關(guān)胃腸道癥狀的原因尚不明確。逍遙散是《太平惠民和劑局方·卷九治婦人諸疾》中記載的一首治療肝郁脾虛證的經(jīng)典方劑。前期研究表明在慢性應(yīng)激方法制備的肝郁脾虛證大鼠模型中,逍遙散具有良好的調(diào)節(jié)作用,其作用機制可能與調(diào)節(jié)異常表達的腦腸肽有關(guān)。但VIP及其受體是否是逍遙散治療肝郁脾虛證的一個作用靶點還有待研究。研究目的觀察中樞(海馬)和外周(結(jié)腸)的VIP及其受體在肝郁脾虛證中的表達,探討肝郁脾虛證的實質(zhì)以及腦腸互動異常的機制,并分析逍遙散的調(diào)節(jié)作用、探討逍遙散治療肝郁脾虛證的作用靶點。研究方法采用六周慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激方法復(fù)制肝郁脾虛證大鼠模型,造模手段包括束縛、熱烘、冰水游泳、陌生物體刺激、白噪音、籠具傾斜、禁食禁水,隨機分配造模手段。造模結(jié)束后通過一般狀態(tài)、體重、攝食量、行為學(xué)檢測(曠場實驗、糖水消耗實驗、強迫游泳實驗),并通過逍遙散、歸脾丸以方測證,用氟西汀作為陽性對照藥,從多角度對所建立的模型進行全面評價。采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測海馬和結(jié)腸 VIP 以及受體VPAC2的表達情況,并觀察逍遙散的調(diào)節(jié)作用。采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測大鼠結(jié)腸部位VIP的含量變化及逍遙散的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果(1)經(jīng)過六周慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激造模之后,模型大鼠出現(xiàn)毛發(fā)枯黃、倦怠少動、大便干濕不調(diào)等一般狀態(tài)變化以及攝食量的降低和體重增加的減緩的現(xiàn)象。行為學(xué)結(jié)果顯示曠場實驗中模型大鼠總穿格數(shù)和修飾次數(shù)減少,強迫游泳不動時間增長,而逍遙散組、氟西汀組大鼠可見相關(guān)指標(biāo)改善,歸脾丸組大鼠部分指標(biāo)有所改善。(2)RT-qPCR實驗結(jié)果表明模型大鼠海馬VIP及VPAC2 mRNA表達顯著升高,結(jié)腸VIP mRNA表達明顯降低,而VPAC2 mRNA表達顯著增加,而灌服逍遙散后大鼠海馬VIPmRNA表達與模型大鼠相比顯著降低。(3)ELISA實驗結(jié)果表明模型大鼠結(jié)腸VIP含量降低,逍遙散組大鼠VIP含量相較模型組增高,蛋白表達情況與基因表達情況一致。研究結(jié)論(1)采用六周慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激方法成功復(fù)制出了肝郁脾虛證大鼠模型,行為學(xué)檢測結(jié)果表明模型大鼠存在著類似于中醫(yī)肝郁脾虛證的情緒抑郁、腹脹食少,大便形態(tài)改變等變化,而運用中藥復(fù)方逍遙散和歸脾丸以方測證,以及治療抑郁癥的經(jīng)典藥物鹽酸氟西汀干預(yù)后各指標(biāo)的逆轉(zhuǎn)也從側(cè)面印證了模型的成功建立。(2)腦腸肽VIP及其受體在中樞(海馬)和外周(結(jié)腸)的異常表達可能是肝郁脾虛證腦腸互動異常的原因之一,結(jié)腸部位VIP含量降低可能是肝郁脾虛證模型大鼠出現(xiàn)食少、便溏、腹脹等的原因之一。(3)逍遙散能不同程度地改善中樞以及外周血管活性腸肽及其受體的異常表達,改善情志抑郁以及腹脹、食少、便溏等胃腸道癥狀,提示逍遙散治療肝郁脾虛證的機制之一可能是通過腦-腸軸調(diào)節(jié)異常表達的VIP。因此,我們認為腦腸肽VIP的異常表達是肝郁脾虛證的生物學(xué)基礎(chǔ)之一。腦腸互動異常導(dǎo)致VIP分泌異常,模型大鼠的進食量和體重出現(xiàn)了明顯的降低,并且伴隨著抑郁樣的情緒狀態(tài)。逍遙散干預(yù)后相關(guān)指標(biāo)的逆轉(zhuǎn)說明其可能通過調(diào)節(jié)中樞及外周VIP及其受體表達從而起到疏肝解郁、調(diào)節(jié)食欲、減少便溏的作用。以此為切入點揭示了肝郁脾虛證腦腸互動異常的機制以及逍遙散作用的靶點。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5;R-332
【部分圖文】：

逑內(nèi)臟與ＣＮＳ聯(lián)系起來的重要神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)［６］。醫(yī)學(xué)研究一般認為，神經(jīng)系統(tǒng)對胃腸運逡逑動的調(diào)控通過三個層次相互協(xié)調(diào)作用來實現(xiàn)（圖１）：第一層次是ＥＮＳ的局部調(diào)控；第逡逑二層次是位于椎前神經(jīng)節(jié)，接受和調(diào)控來自ＥＮＳ和ＣＮＳ兩方面的信息；第三層次是ＣＮＳ，逡逑由腦的各級中樞和脊髓接受機體內(nèi)外環(huán)境變化時傳入的各種信息，經(jīng)過整合再由植物神逡逑經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)－內(nèi)分泌系統(tǒng)將其調(diào)控信息傳送到腸yL經(jīng)系統(tǒng)或直接作用于胃腸效應(yīng)細胞逡逑［７］。胃腸道正是在這種復(fù)雜而精密的神經(jīng)調(diào)控下完成對于機體內(nèi)外環(huán)境的適應(yīng)性活動，逡逑從而實現(xiàn)其生理功能。當(dāng)外源性（味覺、視覺、嗅覺、聽覺、）或內(nèi)感性（情感、心理逡逑因素）信息通過高級中樞傳出的神經(jīng)沖動，可以影響胃腸感覺、運動，導(dǎo)致胃腸道出現(xiàn)逡逑運動異常（對各種應(yīng)激的運動反應(yīng)增強等）和對各種應(yīng)激的敏感性增強，進而出現(xiàn)胃腸逡逑功能的紊亂；反之，胃腸道的不適或異常也可反過來作用于中樞的痛感、情緒和行為。逡逑這種在不同層次將胃腸道與中樞yL經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系起來的神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)稱為腦－腸軸逡逑（Ｂｒａｉｎ－ｇｕｔ邋ａｘｉｓ）。在胃腸道疾病研究中也稱之為腸－腦軸（Ｇｕｔ－ｂｒａｉｎ邋ａｘｉｓ）。機體通過腦－逡逑腸軸之間的神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)這一雙向環(huán)路進行胃腸功能的調(diào)節(jié)作用稱之為腦腸互動逡逑（Ｂｒａｉｎ－ｇｕｔ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）邋0逡逑ｌａｓｌｅ邐，一而？、．．．．．．邋邋逡逑Ｓｍｄｌ邋ｒＷ邋Ｅｍｏｔｉｏｎ邋）＜Ｃ：＾＞ｊ邋Ｂｅｈａｖｉｏｒ邋！逡逑Ｓｉｇｈｔ邐＇邋ｖ％．邋Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．＾邋ｉ邐ｉ逡逑；Ｓｏｕｎｄ邐廠逡逑Ｉ邋Ｐｈｖｂｉｏｌｏａｙ逡逑

化最后生成ＶＩＰ以及ＰＨＭ［Ｕ］（圖１）。其中前體蛋白水解得到的ＶＩＰ產(chǎn)物如下：前原逡逑ＶＩＰ（２２－７９），肽組氨酸異亮氨酸、甲硫氨酸（ＰＨＩ／ＰＨＭ）（８１－１０７），前原邋ＶＩＰ（邋１１１－１２２）、逡逑ＶＩＰ邋（１２５－１５２），和前原ＶＩＰ邋（１５６－１７０）（圖２）。溶液構(gòu)象的結(jié)果指出，ＶＩＰ具有２０％逡逑的螺旋結(jié)構(gòu)，其余８０％是松散無序結(jié)構(gòu)。從結(jié)構(gòu)角度分析，ＶＩＰ的１０？２８位順序?qū)ζ溴义献饔玫膶Ｒ恍暂^為關(guān)鍵［１４］。８0（１0１＾２１＾等人合成了一系列ＶＩＰ類似物，其中ＶＩＰ（７？２８）逡逑具有１５％的生物活性。Ｍａｋｈｌａｕｆ等人研究表明ＶＩＰ的１？８，邋１８？２８，１５？２８和１４？２８逡逑片段均無活性［１５］。在陸地動物進化過程中，ＶＩＰ的初級氨基酸結(jié)構(gòu)保存的很完好，在所逡逑有哺乳動物中，除了在豚鼠中有４個氨基酸替換（８６％個同源性）之外，其余所有哺乳逡逑動物的ＶＩＰ初級氨基酸結(jié)構(gòu)都是相同的；逡逑ＶＩＰ主要由中樞神經(jīng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生，由副交感神經(jīng)節(jié)后纖維所釋放，并與乙逡逑酰膽堿共存。在胃腸道中，ＶＩＰ釋放是由類似于調(diào)節(jié)腸道放松的機制調(diào)節(jié)的。迷走神經(jīng)逡逑和盆腔神經(jīng)的電刺激、前列腺素Ｅ１、催產(chǎn)素、皮質(zhì)酮的刺激都能促進ＶＩＰ的釋放

１．２．１中樞分布逡逑在中樞，ＶＩＰ主要分布于大腦皮層、下丘腦、杏仁核、海馬、視交叉上核、紋狀體逡逑和延髓的迷走神經(jīng)中樞（圖３）。此外在腦的大動脈，特別是Ｗｉｌｌｉｓ環(huán)、脈絡(luò)叢區(qū)域也有逡逑大量分布。在下丘腦某些區(qū)域、皮質(zhì)、杏仁、海馬、紋狀體等處的水平較高。垂體門脈逡逑血中ＶＩＰ的濃度顯著高于外周血［＇邋此外，ＶＩＰ邋Ｉｋ分布于支配腦血管的yL經(jīng)纖維中＿。逡逑１．２．２外周分布逡逑除了中樞以外，血管活性腸肽在外周也有廣泛分布。研究表明血管活性腸肽能神經(jīng)逡逑２６逡逑

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本文編號：2819678