陰道毛滴蟲是一種性傳播原生動物寄生蟲,致病機制尚不清楚。RRas蛋白已證實在細胞的生長、分化、細胞增殖,細胞骨架、細胞粘著和遷移中發(fā)揮重要作用。陰道毛滴蟲RRas蛋白與人類有相似的結(jié)構(gòu)域和功能域,是否對陰道毛滴蟲致病性有關(guān),需要進一步研究。本研究采用基因工程技術(shù)一步克隆并表達了陰道毛滴蟲RRas基因。將重組蛋白純化后,免疫BALB/c小鼠,測其效價,獲得重組蛋白免疫血清,應(yīng)用SDSPAGE和Western blot技術(shù)分析該重組蛋白的免疫原性,并為其在陰道毛滴蟲組織內(nèi)定位做準備。利用CCK8試劑盒檢測陰道毛滴蟲RRas蛋白對人類腫瘤細胞增殖的作用,為探討陰道毛滴蟲RRas蛋白對人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展作用做準備。材料與方法1.陰道毛滴蟲蟲株、質(zhì)粒,菌株,實驗動物及細胞系陰道毛滴蟲(陰道毛滴蟲分離株來自鄭州大學第三附屬醫(yī)院檢驗科門診女性患者)。BALB/c小鼠(雌性、四周齡,河南省實驗動物中心)PQE-80L質(zhì)粒,BL21菌株(由本實驗室保存),所用細胞系為人宮頸癌(HeLa)細胞系(由本實驗室保存)食管癌(Eca-109)細胞系(病理教研室保存)。2.陰道毛滴蟲RRas基因的一步克隆與表達登陸GenBank查陰道毛滴蟲RRas基因的mRNA序列,結(jié)合PQE-80L質(zhì)粒的克隆位點及同源重組序列設(shè)計上下游引物。,提取陰道毛滴蟲的總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過PCR反應(yīng)獲得目的基因經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后,將其克隆至線性化后的表達載體PQE-80L,對重組質(zhì)粒進行測序鑒定,鑒定正確后,將PQE-80L-Tv RRas轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)。對重組質(zhì)粒進行菌落PCR,雙酶切及測序鑒定,鑒定后,用合適濃度IPTG誘導(dǎo)陽性BL21,收集菌體沉淀,經(jīng)一步法細菌活性蛋白提取試劑盒提取蛋白,進行SDS-PAGE,觀察否有目的蛋白表達,并對表達產(chǎn)物的可溶性進行分析。3.陰道毛滴蟲重組蛋白PQE-80L-TvRRas純化及鑒定用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達,用生工生物活性蛋白提取試劑盒提取蛋白,可溶性鑒定后,目的蛋白用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒親和層析純化。進行Western blot分析,鑒定陰道毛滴蟲重組AP51蛋白的免疫原性及抗原性。4.陰道毛滴蟲重組蛋白對人類腫瘤細胞增殖的作用重組蛋白PQE-80L-TvRRas和人hela細胞及Eca-109細胞共培養(yǎng)一個細胞周期后,用CCK8試劑盒檢測其對腫瘤細胞增殖的作用。結(jié)果1.通過雙酶切及測序鑒定,結(jié)果顯示PQE-80L-TvRRas重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(0.5mmol/mlIPTG)誘導(dǎo)表達,SDS-PAGE結(jié)果顯示在26 kDa處新增加一條帶,表明重組蛋白表達成功。所克隆的陰道毛滴蟲RRas基因?qū)﹂L度為664bp,編碼蛋白含有204個氨基酸,等電點為4.81,蛋白大小約為23.6kd,對該蛋白進行可溶性鑒定發(fā)現(xiàn)其以可溶性形式表達。2.Western blot結(jié)果表明,抗His標簽鼠單克隆抗體能夠識別PQE-80L-Tv RRas蛋白,陰道毛滴蟲重組蛋白可被陰道毛滴蟲可溶性抗原免疫BALB/c小鼠血清識別,而不能被正常BALB/c小鼠血清識別。陰道毛滴蟲可溶性蛋白可被陰道毛滴蟲重組蛋白免疫BALB/c小鼠血清識別,而不能被正常BALB/c小鼠血清識別。均在約24KD處顯示明顯條帶,表明該蛋白有較好的抗原性及免疫原性。3.CCK8細胞增殖結(jié)果證明,陰道毛滴蟲重組蛋白對人類腫瘤細胞hela細胞及Eca-109具有促進細胞增殖的作用。結(jié)論1.一步克隆并成功表達了陰道毛滴蟲RRas基因。2.重組蛋白具有良好的抗原性以及免疫原性。3.陰道毛滴蟲RRas重組蛋白與人類腫瘤細胞hela細胞及Eca-109共孵育,與人類RRas蛋白有相同的促進細胞增殖的作用。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：R382.2

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本文編號：2819373