目的:通過靶向血小板的啟動子控制凝血因子Xa(FXa)的表達,將FXa靶向表達于血小板中,并依此構(gòu)建FXa轉(zhuǎn)基因小鼠模型。通過FXa轉(zhuǎn)基因小鼠驗證靶向血小板表達FXa對于血友病B(HB)的治療作用。對于血小板異位表達FXa治療血友病的基因治療方法進行深入研究,確定該方法是否能夠安全有效的治療血友病,解決目前血友病治療過程中出現(xiàn)的問題。方法:選用巨核細胞和血小板特異的αIIb啟動子控制FXa的表達構(gòu)建血小板特異的FXa表達載體(2bFXa)。αIIb啟動子可在小鼠造血干細胞分化產(chǎn)生血小板的過程啟動表達產(chǎn)生FXa,從而達到在血小板中特異表達與儲存FXa的目的。我們將以血友病B小鼠為主要模型,制備2bFXa轉(zhuǎn)基因血友病B小鼠,在轉(zhuǎn)基因小鼠上首先通過FXa ELISA測定FXa的濃度、以化學發(fā)光法測定FXa的活性、Western Blot分析FXa蛋白分子特性,再以激光共聚焦顯微術(shù)確定FXa在血小板中的表達定位,最后通過小鼠的出血量試驗和截尾生存實驗確定小鼠的止血改善情況。結(jié)果:構(gòu)建了2bFXa靶向血小板表達框架,成功制備了2bFXa-HB轉(zhuǎn)基因小鼠模型。尾靜脈收集小鼠靜脈血,分離血小板,在血小板中測定了FXa的濃度與活性,表明轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建成功。通過Western Blot實驗分析確定了靶向表達于血小板中FXa蛋白的分子特性。通過對HB小鼠,野生型(WT)小鼠及2bFXa-HB轉(zhuǎn)基因小鼠進行出血量試驗比較,經(jīng)統(tǒng)計得出WT2bFXa-HBHB,2bFXa-HB轉(zhuǎn)基因小鼠的出血量明顯小于HB小鼠(P0.0001),說明FXa發(fā)揮了顯著的止血作用;進一步在截尾生存實驗中所有2bFXa-HB轉(zhuǎn)基因小鼠都存活,證明小鼠的出血癥狀得到治療。通過激光共聚焦免疫熒光顯微術(shù)確定了FXa成功靶向表達在血小板中的α顆粒中。結(jié)論:2bFXa-HB轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建成功,FXa成功靶向表達于血小板中,且FXa具有活性,通過激光共聚焦熒光顯微術(shù)分析進一步確定FXa在血小板表達。經(jīng)治療小鼠出血量較血友病小鼠顯示減少,FXa發(fā)揮了凝血作用,截尾生存后,2bFXa-HB轉(zhuǎn)基因小鼠存活率為100%,進一步說明治療奏效。
【學位單位】：杭州師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R-332;R554.1
【部分圖文】：

FXa的結(jié)構(gòu)示意圖

對F0代小鼠進行基因型鑒定并檢測FXa含量

血友病B小鼠基因型鑒定電泳圖

【參考文獻】

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本文編號：2818337