【目的】篩選疫苗生產(chǎn)用人3、7型腺病毒培養(yǎng)的細(xì)胞基質(zhì),分離、培養(yǎng)人3、7型腺病毒疫苗候選株,并進(jìn)行空斑純化�！痉椒ā�1、細(xì)胞基質(zhì)的初步篩選:將已有的人3、7型腺病毒株分別感染5種細(xì)胞系:HEK293、AD293、Vero、MRC-5、WI-38,觀察細(xì)胞病變情況和感染滴度,篩選出易感細(xì)胞系。并運(yùn)用初步篩選出的易感細(xì)胞系A(chǔ)D293和MRC-5細(xì)胞分別培養(yǎng)、氯化銫密度梯度離心純化攜帶GFP(Green Fluorescent Protein)基因的重組3型腺病毒感染A549細(xì)胞,觀察細(xì)胞病變情況。從而篩選出一種培養(yǎng)3、7型腺病毒的疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)。2、人3、7型腺病毒毒株分離及免疫:通過MRC-5細(xì)胞分離培養(yǎng)153份咽拭子樣品(廣州;北京)。PCR擴(kuò)增腺病毒的六鄰體蛋白基因、纖突蛋白基因、五鄰體基座蛋白基因并測(cè)序進(jìn)行型別鑒定。腺病毒分離株在MRC-5細(xì)胞中連續(xù)5次傳代后,進(jìn)行病毒感染滴度測(cè)定,篩選出感染滴度≥4.0 lg CCID_(50)/mL的腺病毒株。初步篩選病毒株在MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)3次反復(fù)凍融,離心取上清,病毒上清按1:4000的比例加入β-丙內(nèi)酯滅活,4℃放置24小時(shí),再37℃放置2小時(shí),最后腹腔注射小鼠,免疫劑量500ul/只。對(duì)照組腹腔注射PBS。免疫21天和44天后,獲取血清,滅活后進(jìn)行細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)。3、空斑純化:分別采用Vero、A549、MRC-5細(xì)胞對(duì)腺病毒分離株(其抗體效價(jià)1:8)進(jìn)行空斑純化。純化后腺病毒株采用三個(gè)主要蛋白基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序及血清鑒別試驗(yàn)進(jìn)行型別驗(yàn)證。再使用3種細(xì)胞系(A549、HEK293、MRC-5細(xì)胞)進(jìn)行病毒感染滴度的測(cè)定。4、腺病毒培養(yǎng)條件初步建立:人3型腺病毒BJ-50株和人7型腺病毒BJ-70274株分別使用病毒接種量為0.006MOI、0.012MOI、0.018MOI,培養(yǎng)基含血清濃度為2%、5%、10%,分別在35℃、37℃,含5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),觀察感染后12、24、36、48、60、72、84、96、108小時(shí)在MRC-5細(xì)胞病變的情況和感染滴度�！窘Y(jié)果】1、5種細(xì)胞系中,人3型腺病毒在HEK293細(xì)胞最敏感,其次為MRC-5和AD293細(xì)胞,不敏感細(xì)胞為Vero和WI-38細(xì)胞;人7型腺病毒在HEK293和MRC-5細(xì)胞最敏感,其次為AD293細(xì)胞,不敏感細(xì)胞為Vero和WI-38細(xì)胞。重組3型腺病毒Ad3EGFP在相同培養(yǎng)條件下,MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)獲得總的病毒粒子為3.0×10~(11)而AD293細(xì)胞獲得總的病毒粒子為2.04×10~(12)。但由MRC-5細(xì)胞獲得的Ad3EGFP病毒感染A549細(xì)胞48小時(shí)后,接種1×10~7個(gè)病毒粒子可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光,而AD293細(xì)胞獲得的病毒未見熒光。2、從153份咽拭子中分離得到31株腺病毒,其中21株為人3型腺病毒,10株為人7型腺病毒。篩選出11株病毒滴度"g4.0 lg CCID_(50)/mL的病毒株,其中6株為人3型腺病毒,5株為人7型腺病毒。11株腺病毒經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活后分別進(jìn)行免疫原性檢測(cè),11株病毒株的初次免疫中和效價(jià)均1:8,免疫陽轉(zhuǎn)率達(dá)到100%。初次免疫后,3型腺病毒株BJ-35、BJ-50、BJ-57、BJ-70302、BJ-70248共5株誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)無顯著性差異。BJ-70327株誘導(dǎo)中和抗體效價(jià)均低于其他4株(BJ-35、BJ-50、BJ-57、BJ-70302)。7型腺病毒株誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)無顯著性差異。二次免疫后不同3、7型腺病毒株誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)均無顯著性差異,但二次免疫誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)均高于初次免疫。3、嘗試采用Vero、A549、MRC-5細(xì)胞對(duì)11株腺病毒株進(jìn)行空斑純化,只有Vero細(xì)胞成功將腺病毒空斑純化。純化后病毒株進(jìn)行3個(gè)主要蛋白基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序、血清鑒別實(shí)驗(yàn)均證明腺病毒型別正確。分別使用A549、HEK293、MRC-5細(xì)胞系測(cè)定腺病毒感染滴度,11株腺病毒在MRC-5細(xì)胞和HEK293細(xì)胞的感染滴度一致,其中6株人3型腺病毒和3株人7型腺病毒的感染滴度均為5.0 lg CCID_(50)/ml,另2株人7型腺病毒感染滴度為lg 4.0 lg CCID_(50)/ml。在A549細(xì)胞測(cè)定感染滴度均比另2個(gè)細(xì)胞系高1個(gè)lg值。4、人3型腺病毒BJ-50株和人7型腺病毒BJ-70274株在含10%血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí),接種病毒量分別為0.006、0.012、0.018 MOI,導(dǎo)致病變均較快,培養(yǎng)48-60個(gè)小時(shí)可收獲病毒,但最終收獲的病毒感染滴度均未見明顯差異。在含2%和5%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí),接種病毒量分別為0.006、0.012、0.018 MOI,病毒感染滴度均未見明顯差異,但含5%血清培養(yǎng)病變比2%血清培養(yǎng)的病變快,可提前24個(gè)小時(shí)收毒。無論是35℃還是37℃含5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)均未影響病毒感染滴度,但37℃培養(yǎng)病變較快,可提前24-36個(gè)小時(shí)收獲病毒。人3型腺病毒BJ-50株和人7型腺病毒BJ-70274株分別以0.012MOI病毒量接種于MRC-5細(xì)胞,使用含5%血清的培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)后病毒開始增殖,12-48小時(shí)病毒快速增殖,72小時(shí)細(xì)胞全部病變,48-108小時(shí)病毒滴度維持不變?yōu)?.2 lg CCID_(50)/mL�！窘Y(jié)論】1、從5種細(xì)胞系(HEK293、AD293、Vero、MRC-5、WI-38細(xì)胞)中篩選確定MRC-5細(xì)胞為適合人3、7型腺病毒培養(yǎng)的細(xì)胞基質(zhì)。2、從2015-2017年臨床流行腺病毒感染樣品中分離、空斑純化獲得6株人3型腺病毒疫苗候選株,5株人7型腺病毒疫苗候選株。3、確定疫苗候選株人3型腺病毒BJ-50株和人7型腺病毒BJ-70274株接種培養(yǎng)的合適條件為:采用0.012MOI病毒接種MRC-5細(xì)胞,在含5%血清培養(yǎng)基,5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72hr。4、本研究為人3、7型腺病毒滅活疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

結(jié) 果圖 1-A、B：腺病毒不同細(xì)胞系（AD293、MRC-5 細(xì)胞）培養(yǎng)及純化后感染 A54細(xì)胞（放大倍數(shù) 10×10）圖 1-A：AD293 細(xì)胞生產(chǎn)純化 rAd3EGFP 病毒；圖 1-B：MRC-5 細(xì)胞生產(chǎn)純化rAd3EGFP 病毒。2 腺病毒疫苗候選株篩選結(jié)果2.1 腺病毒分離培養(yǎng)結(jié)果腺病毒感染 MRC-5 細(xì)胞 48 小時(shí)后 CPE 情況見圖 2，MRC-5 細(xì)胞病變?yōu)橹虚g出現(xiàn)脹大、變圓及內(nèi)容物增多。咽拭子標(biāo)本共 153 份，用 MRC-5 細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，共分離出 31 株病毒，結(jié)果見表 6，廣州和北京地區(qū)的標(biāo)本進(jìn)行腺病毒分離培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)顯示培養(yǎng)陽性率無顯著性差異（ X2=1.784，P=0.182）。

廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文檢測(cè),在凝膠成像系統(tǒng)下可見腺病毒六鄰體蛋白基因 Ad3-Hexon 為 13Hexon 為 936bp，見圖 3 所示；纖突蛋白基因 Ad3-Fiber 為 674bp、Ad3bp，見圖 4 所示；五鄰體基座蛋白基因 Ad3-Penton base 為 594bp，Ad7為 594bp 的條帶，與預(yù)期的大小相符，見圖 5 所示。PCR 產(chǎn)物送測(cè)序 比對(duì)，分離 31 株病毒株中 21 株為 3 型腺病毒其中廣州 10 株，北京 11 7 型腺病毒均來自北京，分離株基因型別與臨床分型結(jié)果一致。

分離 31 株病毒株中 21 株為 3 型腺病毒其中廣州 10 株，北京 11 7 型腺病毒均來自北京，分離株基因型別與臨床分型結(jié)果一致。圖 3 PCR 擴(kuò)增腺病毒分離株 3、7 型六鄰體蛋白（Hexon）基因L5000 DNA Marker；1-6：腺病毒 3 型分離株六鄰體蛋白 PCR 產(chǎn)物；7-1 7 型分離株六鄰體蛋白 PCR 產(chǎn)物。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2816206