甲型流感病毒常引起人和動物感染,H5N1亞型禽流感病毒為高致病性禽流感病毒。1997年,香港出現(xiàn)首個人感染H5N1亞型禽流感病毒并引起死亡的病例,高致病性H5N1亞型禽流感對人類健康和財(cái)產(chǎn)造成了巨大損失,在流感疫情發(fā)生初期,建立一種準(zhǔn)確、快速、便捷、高效的檢測方法,對于及時防控疫情的發(fā)展具有重要意義。流感病毒核蛋白(nuclear protein,NP)保守性較高,為流感分型和鑒定的基礎(chǔ)。據(jù)報(bào)道NP蛋白可在原核和真核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá),但各有優(yōu)缺點(diǎn)。膠體金側(cè)向免疫層析試紙條(lateral flow immunochromatographic strip,LFICS)是目前應(yīng)用最廣泛的一種即時檢驗(yàn)(point-of-care testing,POCT)檢測方式,具有成本低、檢測時間短、適用于野外診斷等優(yōu)點(diǎn),可用于流感病毒的早期診斷及檢測體內(nèi)流感抗體產(chǎn)生情況。本研究分別利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)H5N1 A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(clade 2.3.2.1)NP蛋白,分別構(gòu)建含有NP基因的重組載體,轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染E.coli或Sf9細(xì)胞,進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)和表達(dá),應(yīng)用間接免疫熒光、ELISA、SDS-PAGE、WB等方法對表達(dá)的NP蛋白進(jìn)行鑒定。利用兩個系統(tǒng)均能成功表達(dá)目的蛋白,但真核昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的NP蛋白和抗體具有較高的結(jié)合活性,利用此NP蛋白作為標(biāo)記抗原,用競爭法和雙抗原夾心法建立膠體金側(cè)向免疫層析試紙條,根據(jù)特異性和靈敏性分析,昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的NP蛋白更適合用雙抗原夾心法進(jìn)行膠體金側(cè)向免疫層析試紙條的制備。利用此膠體金側(cè)向免疫層析試紙條檢測不同亞型流感病原血清,監(jiān)測不同亞型的流感病毒感染后或疫苗免疫后體內(nèi)抗體產(chǎn)生。我們的研究結(jié)果表明,E.coli原核表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)均能夠表達(dá)NP蛋白,成功利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的NP蛋白以雙抗原夾心法建立膠體金側(cè)向免疫層析試紙條,實(shí)現(xiàn)對流感病毒感染的監(jiān)測及疫苗免疫效果評價,為防控流感病毒感染提供幫助。
【學(xué)位單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65;R373.13
【部分圖文】：

圖 1 LFICS 示意圖品。當(dāng)待測樣品加入到樣品墊上后，在吸水墊的毛細(xì)作用下待測樣品流結(jié)合墊上納米顆粒標(biāo)記的抗體復(fù)合物復(fù)溶，形成樣品-抗體-納米顆粒復(fù)流經(jīng) NC 膜時，又分別和 NC 膜上的 T 檢測線與 C 質(zhì)控線發(fā)生反應(yīng)，根的不同，對 T 線與 C 線的顯色情況進(jìn)行判讀。制備試紙條，首先需要獲得病毒抗原，現(xiàn)有病毒抗原的獲取多采用原核流感 NP 蛋白的原核表達(dá)，通過 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，優(yōu)點(diǎn)是操作、表達(dá)產(chǎn)量高。但原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后幾乎沒有糖基化修飾，表達(dá)的蛋，通過變性和復(fù)性，可將不溶性蛋白恢復(fù)為可溶性蛋白，但需要摸索出性條件。此外原核表達(dá)的蛋白由于缺少相應(yīng)的糖基化修飾等，蛋白的天，可能存在抗原抗體結(jié)合活性低的現(xiàn)象。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)也是常用的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。桿狀病毒的宿主主要的宿主范圍窄，不會感染其他種屬的細(xì)胞，滿足實(shí)驗(yàn)室對操作安全的要

1H5N1NP的PCR擴(kuò)增1Mark2000；2H5N1NP基因PCR產(chǎn)物

圖 2.1.2 H5N1 NP 的菌液 PCMark 2000；2-3 H5N1 NP 菌液 P 2.1.2-1 重組 H5N1 NP 雙酶切驗(yàn)00；2 雙酶切空載；3-6 雙酶切和 Western blot 驗(yàn)證圖 2.1.3 B 的 Western Blot 驗(yàn)

【參考文獻(xiàn)】

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1 梅建國;莊金秋;王金良;王玉茂;丁壯;沈志強(qiáng);;動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)[J];中國生物工程雜志;2012年07期

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本文編號：2815958