目的:脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是來源于脂肪組織、具有自我復制和多種分化潛能的成體干細胞,具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。ADSCs功能的發(fā)揮在很大程度上依賴于其表面表達的分子,與細胞外基質(zhì)及其臨近細胞相互作用,并發(fā)揮對機體的免疫調(diào)節(jié)作用。既往大多數(shù)研究是針對某一個或某幾個細胞表面分子,其弊端是不利于發(fā)現(xiàn)具有重要功能的關(guān)鍵分子以及表型和功能不同的新細胞亞群。人ADSCs參與遷移、歸巢及免疫調(diào)節(jié)作用等的相關(guān)分子表達譜尚未見報道,ADSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機制也尚不完全清楚。本研究擬對體外培養(yǎng)獲得的ADSCs進行表型鑒定及多向分化能力檢測,采用流式細胞術(shù)檢測86種細胞表面標志,以發(fā)現(xiàn)新的參與免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵分子并對其表達和影響因素進行研究,為ADSCs免疫調(diào)節(jié)作用研究及在組織工程與細胞免疫治療方面的臨床應(yīng)用提供科學依據(jù)。研究方法:1、脂肪組織樣本來源:28例供者均為女性,經(jīng)倫理委員會同意及供者知情同意,采集腹部或乳腺皮下脂肪組織約10ml。2、ADSCs體外培養(yǎng):用膠原酶消化后,脂肪組織置于10%FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),細胞長滿80%以上,胰酶消化并傳代。3、ADSCs表型鑒定:第4代貼壁細胞,用抗CD34、CD31、CD45、CD10、CD13、CD29、CD49d、CD90熒光抗體及熒光標記同型對照染色,流式細胞儀檢測。4、ADSCs成脂、成骨、成軟骨分化:分別用成脂、成骨、成軟骨的培養(yǎng)基培養(yǎng),第7天用油紅O、第14天分別用茜素紅S和甲苯胺藍染色,鑒定成脂、成骨和軟骨分化。5、ADSCs表面標志表達譜的檢測:用6種熒光標記的86種抗體對10例ASDCs通過流式細胞儀進行檢測,FlowJo軟件進行分析。6、統(tǒng)計學分析:采用SPSS 19.0和Graph prism 5軟件進行數(shù)據(jù)分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。采用多因素線性回歸分析影響ADSCs的PD-L1和Gal-9表達的因素。P0.05為有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1、表型鑒定:培養(yǎng)的ADSCs細胞不表達CD34、CD31和CD45,高表達CD10、CD13、CD49d、CD29和CD90,符合ADSCs表型特點。2、ADSCs分化能力檢測:成脂誘導后染色,胞漿內(nèi)見大小不等紅色脂肪顆粒;成骨誘導后染色,見橘紅色礦化結(jié)節(jié);成軟骨誘導后染色,細胞核和細胞漿藍色,胞漿內(nèi)見深藍色異染顆粒。提示貼壁細胞具有多種分化能力,符合國際標準。3、ADSCs表面標志表達譜的檢測:流式細胞儀的檢測結(jié)果顯示,ADSCs表達多種與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細胞表面標志。3.1 HLA相關(guān)抗原的表達:ADSCs不表達HLA-DR,表達低水平的HLA-G,66.35%的ADSCs表達HLA-A B C。3.2細胞因子受體的表達:ADSCs表達低水平CD123、CD127、CD25和CD122,不表達的CD124和CDw210。60%-80%的ADSCs表達CD119。3.3趨化因子受體的表達:ADSCs不表達CD192、CD194、CX3CR1、CD181、CD182,表達低水平CD195、CD183,表達高水平的CD184。3.4粘附分子的表達:ADSCs表達CD54、CD226和CD56,不表達CD206、CD209以及CD205。3.5免疫共抑制分子的表達:ADSCs表達低水平Gal-9,同時表達PD-L1和PD-1,不表達TIM-3和CD152。3.6免疫共刺激分子的表達:ADSCs不表達CD80、CD86、CD28和CD40L,但表達低水平的CD40。4、ADSCs的PD-L1表達影響因素:乳腺脂肪組織ADSCs的PD-L1表達(37.24±8.2%)顯著高于腹部(28.8±8.59%)(P=0.018)。多因素線性回歸分析顯示,年齡和采集部位顯著影響PD-L1表達,BMI不是影響ADSCs PD-L1表達的因素。線性回歸方程為:PD-L1~+ADSCs(%)=34.437+8.58×部位(腹部=0,乳腺=1)+(-0.385×年齡)。年齡每增加1歲,PD-L1表達降低0.385%。5、ADSCs的Gal-9表達影響因素:乳腺脂肪組織ADSCs的Gal-9表達(4.41±2.65%)顯著高于腹部(2.51±1.39%)(P=0.039)。多因素線性回歸分析顯示,采集部位是影響ADSCs的Gal-9表達的獨立危險因素,年齡和BMI不是影響ADSCs Gal-9表達的獨立危險因素。線性回歸方程為:Gal-9~+ADSCs(%)=0.623+1.894×部位(腹部=0,乳腺=1)。結(jié)論:1、腹部和乳腺均是人ADSCs的可靠來源。2、人ADSCs表達多種細胞因子受體、趨化因子受體、粘附分子以及免疫調(diào)節(jié)性分子,不表達或低表達多種共刺激分子。3、人ADSCs表達重要的免疫共抑制分子PD-L1和Gal-9,供者年齡、采集部位顯著影響ADSCs的PD-L1和Gal-9表達。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

中國醫(yī)科大學碩士學位論文CD34、內(nèi)皮細胞標志 CD31 以及白細胞標志 CD45，CD10、CD13、CD49d、CD29和 CD90 的陽性細胞百分比分別為 98.1%（）高表達 CD10、CD13、CD49d、CD29和 CD90（圖 1B），提示 28 例第 4 代的貼壁細胞符合 ADSCs 表面標志特點[6]。CD90出現(xiàn)雙峰，提示并非全部的人 ADSCs 均表達 CD90，與 Chung 等的研究報道一致[10]。

ADSCs分化能力檢測A．成脂分化：油紅O染色顯示，成脂誘導培養(yǎng)7天，細胞漿內(nèi)見紅色油滴

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Patrick C Baer;;Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: An update on their phenotype in vivo and in vitro[J];World Journal of Stem Cells;2014年03期

2 彭鑫磊;王蕊;周向榮;劉秋英;王一飛;;脂肪干細胞的研究及應(yīng)用進展[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2010年12期

3 閻繼紅;齊念民;;脂肪組織來源的干細胞的研究進展[J];國際生物醫(yī)學工程雜志;2007年03期

本文編號：2813024