目的:脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是來(lái)源于脂肪組織、具有自我復(fù)制和多種分化潛能的成體干細(xì)胞,具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。ADSCs功能的發(fā)揮在很大程度上依賴(lài)于其表面表達(dá)的分子,與細(xì)胞外基質(zhì)及其臨近細(xì)胞相互作用,并發(fā)揮對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。既往大多數(shù)研究是針對(duì)某一個(gè)或某幾個(gè)細(xì)胞表面分子,其弊端是不利于發(fā)現(xiàn)具有重要功能的關(guān)鍵分子以及表型和功能不同的新細(xì)胞亞群。人ADSCs參與遷移、歸巢及免疫調(diào)節(jié)作用等的相關(guān)分子表達(dá)譜尚未見(jiàn)報(bào)道,ADSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制也尚不完全清楚。本研究擬對(duì)體外培養(yǎng)獲得的ADSCs進(jìn)行表型鑒定及多向分化能力檢測(cè),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)86種細(xì)胞表面標(biāo)志,以發(fā)現(xiàn)新的參與免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵分子并對(duì)其表達(dá)和影響因素進(jìn)行研究,為ADSCs免疫調(diào)節(jié)作用研究及在組織工程與細(xì)胞免疫治療方面的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。研究方法:1、脂肪組織樣本來(lái)源:28例供者均為女性,經(jīng)倫理委員會(huì)同意及供者知情同意,采集腹部或乳腺皮下脂肪組織約10ml。2、ADSCs體外培養(yǎng):用膠原酶消化后,脂肪組織置于10%FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)80%以上,胰酶消化并傳代。3、ADSCs表型鑒定:第4代貼壁細(xì)胞,用抗CD34、CD31、CD45、CD10、CD13、CD29、CD49d、CD90熒光抗體及熒光標(biāo)記同型對(duì)照染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。4、ADSCs成脂、成骨、成軟骨分化:分別用成脂、成骨、成軟骨的培養(yǎng)基培養(yǎng),第7天用油紅O、第14天分別用茜素紅S和甲苯胺藍(lán)染色,鑒定成脂、成骨和軟骨分化。5、ADSCs表面標(biāo)志表達(dá)譜的檢測(cè):用6種熒光標(biāo)記的86種抗體對(duì)10例ASDCs通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),FlowJo軟件進(jìn)行分析。6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS 19.0和Graph prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用多因素線性回歸分析影響ADSCs的PD-L1和Gal-9表達(dá)的因素。P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、表型鑒定:培養(yǎng)的ADSCs細(xì)胞不表達(dá)CD34、CD31和CD45,高表達(dá)CD10、CD13、CD49d、CD29和CD90,符合ADSCs表型特點(diǎn)。2、ADSCs分化能力檢測(cè):成脂誘導(dǎo)后染色,胞漿內(nèi)見(jiàn)大小不等紅色脂肪顆粒;成骨誘導(dǎo)后染色,見(jiàn)橘紅色礦化結(jié)節(jié);成軟骨誘導(dǎo)后染色,細(xì)胞核和細(xì)胞漿藍(lán)色,胞漿內(nèi)見(jiàn)深藍(lán)色異染顆粒。提示貼壁細(xì)胞具有多種分化能力,符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。3、ADSCs表面標(biāo)志表達(dá)譜的檢測(cè):流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果顯示,ADSCs表達(dá)多種與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志。3.1 HLA相關(guān)抗原的表達(dá):ADSCs不表達(dá)HLA-DR,表達(dá)低水平的HLA-G,66.35%的ADSCs表達(dá)HLA-A B C。3.2細(xì)胞因子受體的表達(dá):ADSCs表達(dá)低水平CD123、CD127、CD25和CD122,不表達(dá)的CD124和CDw210。60%-80%的ADSCs表達(dá)CD119。3.3趨化因子受體的表達(dá):ADSCs不表達(dá)CD192、CD194、CX3CR1、CD181、CD182,表達(dá)低水平CD195、CD183,表達(dá)高水平的CD184。3.4粘附分子的表達(dá):ADSCs表達(dá)CD54、CD226和CD56,不表達(dá)CD206、CD209以及CD205。3.5免疫共抑制分子的表達(dá):ADSCs表達(dá)低水平Gal-9,同時(shí)表達(dá)PD-L1和PD-1,不表達(dá)TIM-3和CD152。3.6免疫共刺激分子的表達(dá):ADSCs不表達(dá)CD80、CD86、CD28和CD40L,但表達(dá)低水平的CD40。4、ADSCs的PD-L1表達(dá)影響因素:乳腺脂肪組織ADSCs的PD-L1表達(dá)(37.24±8.2%)顯著高于腹部(28.8±8.59%)(P=0.018)。多因素線性回歸分析顯示,年齡和采集部位顯著影響PD-L1表達(dá),BMI不是影響ADSCs PD-L1表達(dá)的因素。線性回歸方程為:PD-L1~+ADSCs(%)=34.437+8.58×部位(腹部=0,乳腺=1)+(-0.385×年齡)。年齡每增加1歲,PD-L1表達(dá)降低0.385%。5、ADSCs的Gal-9表達(dá)影響因素:乳腺脂肪組織ADSCs的Gal-9表達(dá)(4.41±2.65%)顯著高于腹部(2.51±1.39%)(P=0.039)。多因素線性回歸分析顯示,采集部位是影響ADSCs的Gal-9表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,年齡和BMI不是影響ADSCs Gal-9表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。線性回歸方程為:Gal-9~+ADSCs(%)=0.623+1.894×部位(腹部=0,乳腺=1)。結(jié)論:1、腹部和乳腺均是人ADSCs的可靠來(lái)源。2、人ADSCs表達(dá)多種細(xì)胞因子受體、趨化因子受體、粘附分子以及免疫調(diào)節(jié)性分子,不表達(dá)或低表達(dá)多種共刺激分子。3、人ADSCs表達(dá)重要的免疫共抑制分子PD-L1和Gal-9,供者年齡、采集部位顯著影響ADSCs的PD-L1和Gal-9表達(dá)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R329.2
【部分圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文CD34、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志 CD31 以及白細(xì)胞標(biāo)志 CD45，CD10、CD13、CD49d、CD29和 CD90 的陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別為 98.1%（）高表達(dá) CD10、CD13、CD49d、CD29和 CD90（圖 1B），提示 28 例第 4 代的貼壁細(xì)胞符合 ADSCs 表面標(biāo)志特點(diǎn)[6]。CD90出現(xiàn)雙峰，提示并非全部的人 ADSCs 均表達(dá) CD90，與 Chung 等的研究報(bào)道一致[10]。

ADSCs分化能力檢測(cè)A．成脂分化：油紅O染色顯示，成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)7天，細(xì)胞漿內(nèi)見(jiàn)紅色油滴

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Patrick C Baer;;Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: An update on their phenotype in vivo and in vitro[J];World Journal of Stem Cells;2014年03期

2 彭鑫磊;王蕊;周向榮;劉秋英;王一飛;;脂肪干細(xì)胞的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2010年12期

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本文編號(hào)：2813024