人腺病毒(Human Adenovirus, HAdV)是一類無包膜的雙鏈DNA病毒,分為A-G7個(gè)血清學(xué)組,包括56個(gè)血清型。HAdV經(jīng)呼吸道和消化道傳播,可引起人多種器官感染,對(duì)小兒和免疫缺陷者危害尤為嚴(yán)重。HAdV感染人體可引發(fā)急性腺病毒型肺炎、急性胃腸炎、眼角膜炎、乳糜瀉和急性間質(zhì)性腎炎等多種疾病。 其中HAdV-B組感染目前已成為急性呼吸系統(tǒng)疾病(Acute Respiratory Disease, ARD)的重要因素。超過5%的急性呼吸道傳染病為HAdV感染所致,特別是在急性下呼吸道感染兒童患者中HAdV感染陽性率最高可達(dá)37.3%。近年來,B2亞組中出現(xiàn)的新型HAdV-B55在成人特別是學(xué)校和軍隊(duì)特殊人群中引起日益頻繁的急性呼吸道傳染病流行。我國2009年首次報(bào)道了HAdV-B55疫情,導(dǎo)致247名師生及市民發(fā)病,1名學(xué)生死亡�？紤]到]HAdV并未列入我國傳染病監(jiān)控病原,現(xiàn)有報(bào)道的HAdV疫情大多未鑒定型別,因此HAdV-B55在我國引起的成人急性呼吸道傳染病流行可能遠(yuǎn)高于實(shí)際報(bào)道病例,其潛在威脅不容忽視。 由于抗原性上與HAdV-B11的聯(lián)系和差異,HAdV-B55早期被命名為HAdV-B11a。經(jīng)全基因組序列測定和生物信息學(xué)分析,HAdV-B55實(shí)際為HAdV-B11和14的Hexon基因重組突變體。HAdV-B55作為一個(gè)新近受到關(guān)注的呼吸道感染類腺病毒,基因組及生物學(xué)特征均未明確。傳統(tǒng)的HAdV-B11主要導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)的感染,HAdV-B14和55則主要引起呼吸系統(tǒng)感染。因此,明確HAdV-B55的基因組及生物學(xué)特征,闡明重組HAdV-B55與其親本病毒的聯(lián)系及差異,以及進(jìn)一步探討呼吸道HAdV重組與其致病性上的聯(lián)系,將可加深對(duì)呼吸道HAdV病原學(xué)的認(rèn)識(shí),并為進(jìn)一步研究其重組與致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 本項(xiàng)研究從HAdV感染咽拭子樣本中,利用敏感細(xì)胞系分離獲得了HAdV-B55病毒株,完成了病原學(xué)鑒定,對(duì)其基因組特征及其進(jìn)化重組進(jìn)行了分析,并進(jìn)一步針對(duì)病毒重組,對(duì)HAdV-B55與親本病毒11和14型在生物學(xué)特征上的差異進(jìn)行了系統(tǒng)比較,明確了HAdV-B55型重組后生物特征學(xué)上的改變,并初步探討了HAdV重組對(duì)病毒生物學(xué)特性的影響及其與致病性之間的聯(lián)系。 一、新型HAdV-B55的分離與鑒定 我們自2011年山西HAdV-B55疫情中,從臨床咽拭子樣本中分離獲得了HAdV-B55毒株Y16/SX/2011(簡稱Y16)。該毒株可感染呼吸道細(xì)胞系A(chǔ)549及HEp2,并引起明顯的細(xì)胞病變,A549細(xì)胞在感染24小時(shí)后即可觀察到細(xì)胞腫脹及圓縮等病變現(xiàn)象,隨著感染時(shí)間的延長,在感染48小時(shí)后細(xì)胞逐步出現(xiàn)了類似拉網(wǎng)樣空泡,而在感染5天后可導(dǎo)致細(xì)胞完全圓縮、脫落、融解。分離株可在A549細(xì)胞上有效增殖,病毒滴度最高可達(dá)2.45×108PFU/ml,并形成大小均一的噬斑形態(tài)。在電鏡下觀察HAdV-B55型病毒顆粒,HAdV-B55型具有與其他HAdV相似的電鏡形態(tài),呈現(xiàn)典型的二十面體形態(tài)。在感染細(xì)胞后,細(xì)胞顆粒主要集中于細(xì)胞核內(nèi),呈晶格狀排列。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示Y16分離株無法感染小鼠和增殖,僅可引起非特異的病理性損傷。上述分離株病原學(xué)特征的初步鑒定,為進(jìn)一步開展HAdV-B55型基因組分析、致病機(jī)制及疫苗的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 二、HAdV-B55分離株基因組特征與進(jìn)化重組分析 為了進(jìn)一步分析Y16分離株的基因組及進(jìn)化特征,我們對(duì)其全長基因進(jìn)行了序列測定和基因組標(biāo)注,并進(jìn)一步以Genbank公布的HAdVB組序列為依據(jù),進(jìn)行了進(jìn)化分析。基于全基因組序列的進(jìn)化關(guān)系顯示Y16分離株屬于]QS-AdVB2亞組。序列同源性分析表明Y16株與我國2006年山西的QS-DLL分離株相似度高,僅有8個(gè)核苷酸上的差異；與HAdV-B11的同源性為97.6%,而與HAdV-B14的同源性為98.9%。進(jìn)一步對(duì)Y16主要表面衣殼蛋白Hexon、Fiber、Penton及E1A蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示分離株的Hexon與HAdV-B11型同源性較14型高為97.4%,與HAdV-B14型的同源性僅為92.5%；但其他幾個(gè)蛋白如Fiber、Penton及E1A蛋白與HAdV-B14型的同源性均高于99%,顯著高于分離株與HAdV-B11型的同源性。對(duì)分離株的進(jìn)化關(guān)系分析同樣證實(shí)了上述結(jié)果,基于編碼蛋白Hexon、 Fiber、Penton及E1A基因的進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),Y16的Hexon基因進(jìn)化關(guān)系與HAdV-B11相近,而Fiber、Penton及E1A基因及進(jìn)化關(guān)系均與HAdV-B14型屬同一進(jìn)行分支。進(jìn)一步對(duì)Y16毒株進(jìn)行重組分析,發(fā)現(xiàn)本次分離到的Y16株為HAdV-B11型的Hexon蛋白和14型重組后的新型]HAdV,其重組區(qū)為18695-19587位核苷酸區(qū),其重組特征與之前文獻(xiàn)報(bào)道一致。這些結(jié)果明確了我國HAdV-B55型的基因組及其變異情況,為HAdV流行分析與溯源,疫苗研制及制訂疾病防控策略等提供理論依據(jù)。 三、HAdV-B55與重組親本病毒HAdV11/14的病原學(xué)比較研究 為了明確HAdV重組對(duì)HAdV-B55生物學(xué)特征和致病性的影響,我們系統(tǒng)比較了重組Y16分離株與其親本病毒HAdV-B11和14型細(xì)胞組織嗜性和體外生物學(xué)特征、不同溫度環(huán)境中在細(xì)胞內(nèi)的病毒增殖能力、蝕斑形態(tài)、生長曲線、熱穩(wěn)定性、誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡、細(xì)胞吸附能力和干擾素的動(dòng)態(tài)變化等方面的差異。 研究結(jié)果顯示,HAdV-B55具有與HAdV-B11和14類似的一些生物學(xué)特征。三個(gè)型別的腺病毒均具有廣譜細(xì)胞嗜性,在不同組織來源的細(xì)胞系內(nèi)均可以實(shí)現(xiàn)有效的增殖；在A549細(xì)胞上均可形成典型的蝕斑形態(tài)。此外,三個(gè)型別]HAdV也可抑制細(xì)胞內(nèi)干擾素的產(chǎn)生。電鏡下未發(fā)現(xiàn)形態(tài)存在顯著差異。 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)HAdV-B55與HAdV-B11和14體外致病性存在一些顯著差異。HAdV-B55在A549、RD、HEp2、HepG2、HEK293和HeLa等六類細(xì)胞系內(nèi)致病變能力、細(xì)胞毒性以及致細(xì)胞凋亡能力均明顯弱于親本病毒11及14型；上述特征將有利于病毒在細(xì)胞中的持續(xù)增殖。在模擬上呼吸道環(huán)境中,HAdV-B55增殖與HAdV-B14接近,但均快于HAdV-B11;在下呼吸道模擬環(huán)境中,HAdV-B55的增殖顯著快于HAdV-B11和14,且在A549細(xì)胞上的蝕斑形態(tài)顯著大于親本病毒HAdV-B11和14型。在熱穩(wěn)定性比較分析中,我們發(fā)現(xiàn)]HAdV-B55型在37℃時(shí)的熱穩(wěn)定性明顯弱于親本病毒11和14型的穩(wěn)定性。上述結(jié)果提示基因重組與氨基酸突變?cè)贖AdV-B55型致病機(jī)制中的重要作用,HAdV衣殼蛋白Hexon的重組,可能與HAdV的復(fù)制能力及熱穩(wěn)定性存在著聯(lián)系。本部分的研究結(jié)果為下一步揭示基因重組與HAdV毒力變異的關(guān)聯(lián)這一科學(xué)問題,為深入探索和闡明不同HAdV致病機(jī)制與流行特征奠定了基礎(chǔ)。 四、HAdV55快速檢測方法的建立及評(píng)價(jià) 為滿足HAdV-B55快速檢測篩查的需要,我們分別建立了環(huán)介導(dǎo)等溫快速檢測方法、實(shí)時(shí)PCR檢測方法和區(qū)分HAdV-B11/14/55的多重PCR檢測方法等。這些方法具有較好的敏感性和特異性。其中]HAdV-B55特異LAMP檢測方法,靈敏度與實(shí)時(shí)定量PCR相當(dāng),均可以檢測到0.008PFU/反應(yīng)；同時(shí),該方法還可無須提取核酸過程直接對(duì)樣本進(jìn)行檢測,極大方便了對(duì)HAdV感染的甄別。我們將上述建立的三種快速檢測方法應(yīng)用到臨床樣本的檢測中。實(shí)驗(yàn)證明三種方法均具有良好的特異性和靈敏度,可適應(yīng)在不同環(huán)境中HAdV-B55檢測及鑒定,可為臨床及基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)/野外提供快速準(zhǔn)確的診斷信息。 本研究成功對(duì)人腺病毒55型Y16/SX/2011株進(jìn)行了分離與鑒定,并完成全基因組序列測定與分析,明確了其與我國QS-DLL腺病毒55型分離株的8個(gè)核苷酸差異及其進(jìn)化特征,重組分析顯示分離株為HAdV-B11和14型的重組產(chǎn)物。進(jìn)一步的病原學(xué)比較研究顯示,HAdV-B55分離株在細(xì)胞嗜性,呼吸道細(xì)胞系上的增殖能力均強(qiáng)于親本病毒11和14型,而細(xì)胞毒性及致細(xì)胞凋亡能力則弱于親本株。本研究對(duì)HAdV-B55基因組特征與生物學(xué)特征的闡明,以及與其重組親本的病原學(xué)比較,為深入研究腺病毒進(jìn)化重組機(jī)制及其對(duì)病毒致病性的影響奠定了基礎(chǔ),并為腺病毒的防控及疫苗的研究提供了科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R373.1
【部分圖文】：

圖1-1Y16分離株A549細(xì)胞的細(xì)胞病變特征（@37°C)A：未感染病毒A549細(xì)胞，B?F:分別為感染病毒1?5天后A549細(xì)胞病變特征Figure 1-1 CPE results ofY16/SX/2011 strain on A549 cells in 37°CA: Negative control, B-F; 1-5 days post infection2.1.2. Y16分離株30°C時(shí)對(duì)HEp2細(xì)胞致病變特征

圖1-2 Y16株在HEp2細(xì)胞病變特征（@3(rC)A：未感染病毒HEp2細(xì)胞，B?F:分別為感染病毒1?7天后A549細(xì)胞病變特征FIG 1-2 CPE results ofY16/SX/2011 strain on HEp2 cells in 30^0A: Negative control, B-H: 1-7 days post infection2.2分離株病毒燭斑鑒定為了分析分離株的感染能力及增殖特性，我們利用病毒燭斑試驗(yàn)來對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。t蟲斑實(shí)驗(yàn)中，將分離病毒感染A549細(xì)胞第3天后即可觀察到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，并隨著感染時(shí)間的延長燭斑逐漸增大。在觀察至第5天時(shí)以甲醛固定、結(jié)晶紫染色后進(jìn)一步觀察其燭斑形態(tài)，以未感染病毒細(xì)胞作為陰性對(duì)照。結(jié)果如圖1-3顯示，病毒在A549細(xì)胞上能形成肉眼可見的典型燭斑形態(tài)，且燭斑形成數(shù)目與病毒稀釋度呈正相關(guān)。隨機(jī)計(jì)數(shù)25個(gè)空斑后測量其空斑大小為0.32±0.066mm。

‘ a‘： *??. 、)?‘ -V *■.. -. 廣?>V ■ ■：6dpi 7dpi. ■：1-2 Y16株在HEp2細(xì)胞病變特征（@3(rC)HEp2細(xì)胞，B?F:分別為感染病毒1?7天后A549細(xì)1-2 CPE results ofY16/SX/2011 strain on HEp2 cells in 30^0A: Negative control, B-H: 1-7 days post infection斑鑒定離株的感染能力及增殖特性，我們利用病毒燭斑試驗(yàn)中，將分離病毒感染A549細(xì)胞第3天后即可觀察到感染時(shí)間的延長燭斑逐漸增大。在觀察至第5天時(shí)一步觀察其燭斑形態(tài)，以未感染病毒細(xì)胞作為陰性對(duì)在A549細(xì)胞上能形成肉眼可見的典型燭斑形態(tài)，度呈正相關(guān)。隨機(jī)計(jì)數(shù)25個(gè)空斑后測量其空斑

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本文編號(hào)：2814269