乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染嚴(yán)重威脅人類的健康,接種乙型肝炎疫苗(乙肝疫苗)可以有效預(yù)防HBV的感染。但正常人群中有5-10%的乙肝疫苗無應(yīng)答者,他們在接種三針乙肝疫苗后抗體10 m IU/ml,無法達(dá)到保護(hù)性水平,可能處于乙肝感染的威脅之中。之前對無應(yīng)答成因的研究多是針對單一因素,如HLA、SNP等,且均為對單一時間點的分析,我們希望通過從再次接種乙肝疫苗前后的多個時間點進(jìn)行無應(yīng)答者轉(zhuǎn)錄組研究,對無應(yīng)答相關(guān)基因變化及內(nèi)在聯(lián)系進(jìn)行多角度分析,結(jié)合免疫特征的研究,對無應(yīng)答的形成機制進(jìn)行探索。由于無應(yīng)答者再次加強免疫三針后90%的人會出現(xiàn)抗體應(yīng)答,為了更為準(zhǔn)確的探究無應(yīng)答者在基因及免疫應(yīng)答方面的特征性機制,本研究選擇了經(jīng)過2輪3針乙肝疫苗免疫后仍無應(yīng)答的人群作為研究對象,由于這種無應(yīng)答者在普通人群中占比很低,我們從1134名無乙肝疫苗免疫和感染史的人群中進(jìn)行篩選,最終獲得了7名無應(yīng)答者,并以7名正常應(yīng)答者作為對照,采用轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜芯片對應(yīng)答者和無應(yīng)答者外周血單個核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)譜對比分析,為了增加芯片分析結(jié)果的可靠性,我們選擇了再次進(jìn)行乙肝疫苗接種前和接種后共5個時間點的PBMC樣本進(jìn)行分析,通過匯總分析各時間點結(jié)果并互為驗證,以獲得更為可信的結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn):1.在疫苗免疫前后,無應(yīng)答者與應(yīng)答者存在大量差異表達(dá)基因;2.Gene Ontology富集分析顯示差異基因的富集分類多為免疫反應(yīng)相關(guān)基因;3.在免疫前后的5個時間點中,兩組人群中持續(xù)存在相同的差異表達(dá)基因,其中參與機體免疫反應(yīng)的包括BPI、DEFA1B、DEFA4、MMP8,參與維生素、鐵離子及葡萄糖代謝的FLOR3、LTF、TKTL1,這些基因并未隨著疫苗接種而發(fā)生變化,作為無應(yīng)答者的轉(zhuǎn)錄組基因區(qū)別于應(yīng)答者的特點之一,這7個在免疫反應(yīng)及維生素等物質(zhì)代謝相關(guān)的基因的異常表達(dá)或許是針對乙肝疫苗的無應(yīng)答形成的機制之一。同時我們還發(fā)現(xiàn),無應(yīng)答者血漿中IL-27和CXCL12兩種細(xì)胞因子濃度分別在一針免疫后3天和二針免疫后7天顯著低于應(yīng)答者,而無應(yīng)答者PBMC經(jīng)體外刺激后發(fā)現(xiàn),其抗原特異性IL-2、IL-4分泌顯著低于應(yīng)答者,但針對其他病原體的體液免疫反應(yīng)正常,由此提示無應(yīng)答者針對乙肝抗原的提呈細(xì)胞吞噬處理功能、Th細(xì)胞活化功能和B細(xì)胞特異結(jié)合乙肝抗原并活化能力可能存在障礙。動物體內(nèi)試驗顯示NK細(xì)胞功能缺陷并未影響針對乙肝疫苗的免疫反應(yīng),但低周齡小鼠由于免疫系統(tǒng)的發(fā)育不成熟會導(dǎo)致乙肝疫苗的低反應(yīng)性。本研究從轉(zhuǎn)錄組和多細(xì)胞因子水平對乙肝疫苗無應(yīng)答者的基因表達(dá)譜和細(xì)胞因子分泌等方面分析了無應(yīng)答者的特征,同時對影響免疫反應(yīng)的可能因素進(jìn)行了初步探索,發(fā)現(xiàn)無應(yīng)答者與正常應(yīng)答者之間持續(xù)存在的差異表達(dá)基因及細(xì)胞因子分泌能力的降低,為從基因表達(dá)及免疫反應(yīng)水平解釋無應(yīng)答形成機制提供了數(shù)據(jù)支持,為無應(yīng)答者的早期預(yù)測和后續(xù)開發(fā)增強無應(yīng)答者應(yīng)答水平的新型乙肝疫苗提供了潛在的目標(biāo)靶點。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

第一章 緒 論Lucifora 等使用 HBx 缺陷的 HBV 顆粒與 HepaRG 細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)缺陷型顆粒無法在細(xì)胞中擴(kuò)增，但其與野生型 HBV 的 cccDNA 入核數(shù)量相當(dāng)，從而證實 HB并非組裝入病毒顆粒中而是在病毒感染宿主細(xì)胞后分泌出來調(diào)控 cccDNA 轉(zhuǎn)錄其在病毒感染過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，對啟動和維持 HBV 病毒復(fù)制具有重要意義[21]。而 HBx 蛋白發(fā)揮的感染調(diào)節(jié)作用主要是與感染細(xì)胞中 DNA 損傷結(jié)合蛋白（DDB1）結(jié)合，導(dǎo)致 STAT1 泛素化并降解，從而抑制了干擾素反應(yīng)[22, 23]。1.2 HBV 免疫病理

2.1 人群篩選、入組及血樣采集流程經(jīng)過問卷調(diào)查和乙肝指標(biāo)初篩后選擇了 1134 名無乙肝疫苗免疫史及感染史的人群，經(jīng)過 2 輪 3 針乙肝疫苗免疫后獲得了 12 名無應(yīng)答者，經(jīng)再次復(fù)核乙肝五項及 HBV DNA 指標(biāo)后共 7 名無應(yīng)答者入組，同時選擇了 7 名正常應(yīng)答者作為對照。所有人群均已經(jīng)過體檢排除乙肝、HIV、丙肝感染，且無糖尿病、結(jié)核病及腎透析等慢性病史，并符合年齡<50 歲，身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）<28，無吸煙史的入組標(biāo)準(zhǔn)。所有 14 名入組者均按照 0、4w、8w 程序，依照說明書要求接種 3 針重組乙型肝炎疫苗（釀酒酵母）（20μg/ml，深圳康泰生物制品股份有限公司）。在 1 針接種前（Day 0）、1 針后 3 天（Day 3）、7 天（Day 7）、28 天（Day 28），2 針后 7 天（Day 35），3 針后 28 天（Day 56）采集 EDTA 抗凝血。接種、采血及試驗流程見圖 1。

3 結(jié)果3.1 人群篩選及入組人群基本信息根據(jù)試驗方案，對初期招募人群進(jìn)行問卷調(diào)查及采血初篩，問卷調(diào)查除基本信息外還包括乙肝疫苗免疫史，家庭乙肝感染情況，是否有其他慢性疾病等；設(shè)定的人群入組標(biāo)準(zhǔn)，即：無急慢性感染，年齡≤50 歲， BMI<28，無吸煙史等。采血后測定 HBsAg、抗-HBs 和抗-HBc，選擇三項指標(biāo)全部為陰性者納入后續(xù)研究，共獲得了 1134 名無乙肝疫苗免疫史及感染史的人群。此人群經(jīng)過 3 針乙肝疫苗接種，測定抗-HBs，共獲得了 104 名抗-HBs < 10 mIU/ml 的無應(yīng)答者，這些無應(yīng)答者再次接受3針乙肝疫苗免疫后，有12名經(jīng)過2輪3針免疫后抗-HBs < 10mIU/ml 的無應(yīng)答者，此為我們的目標(biāo)研究人群（圖 2.2）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 邱少輝;張然;方鑫;何鵬;梁爭論;鄭直;胡忠玉;;重組乙型肝炎疫苗免疫小鼠后早期免疫相關(guān)因子的反應(yīng)[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2014年06期

本文編號：2811435