研究背景在急性炎癥或者全身炎性反應(yīng)時,腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNFα)的表達升高伴隨著組織器官上皮完整性的破壞,進而導(dǎo)致間隙增大,通透性增加,蛋白和液體滲漏,嚴重時引起器官功能障礙。在細胞水平,腫瘤壞死因子α可以使E-鈣黏蛋白表達下降。E-鈣黏蛋白的下調(diào)或缺失,降低細胞與細胞之間粘附的程度,進而導(dǎo)致上皮細胞的通透性和細胞活動性的增加。深入了解E-鈣黏蛋白調(diào)節(jié)的分子機制,有助于提高我們對上皮屏障功能障礙引起的疾病的認識。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,TRAF2)是一種重要的接頭蛋白,參與腫瘤壞死因子α介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng),并發(fā)揮重要作用。TRAF2在腫瘤壞死因子α的刺激后能夠募集到TNFR1或者TNFR2,調(diào)節(jié)NF-κB和c-Jun N terminal kinase(JNK)信號級聯(lián)反應(yīng)的激活。JNK參與調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白介導(dǎo)的細胞粘附連接已經(jīng)被報道,但是TRAF2是否參與調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白的表達尚無闡述。研究表明,泛素化修飾參與調(diào)節(jié)TRAF2的活性,但是哪種去泛素化酶能夠調(diào)節(jié)TRAF2蛋白穩(wěn)定性還需探索。最近有研究表明,去泛素化酶USP48,也稱做USP31,能夠與TRAF2蛋白相互結(jié)合,但是否影響TRAF2蛋白的活性和穩(wěn)定性還尚無論證。目前USP48的生理功能還不是很明確,但其廣泛表達于各種組織器官中,提示可能參與多種必需的去泛素化過程。因此本課題擬深入研究去泛素化酶USP48和TRAF2結(jié)合的生理意義及其是否影響下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究方法1.通過免疫印跡法明確US48對TRAF2蛋白水平的影響;通過實時熒光定量PCR檢測USP48對TRAF2 m RNA水平的影響。2.通過細胞內(nèi)泛素分析檢測USP48對TRAF2泛素化的影響;通過免疫共沉淀明確USP48和TRAF2的相互結(jié)合;通過免疫染色明確USP48和TRAF2的細胞內(nèi)定位。3.通過免疫沉淀反應(yīng)檢測TNFα和GSK3β使USP48發(fā)生磷酸化;通過免疫共沉淀明確USP48和GSK3β的相互結(jié)合;通過免疫染色明確USP48和GSK3β的細胞內(nèi)定位。4.通過免疫印跡法明確GSK3β對TRAF2蛋白水平表達的影響;通過細胞內(nèi)泛素分析檢測GSK3β對TRAF2泛素化的影響。5.通過體外合成系統(tǒng)合成重組的USP48野生型和突變型蛋白;通過體外去泛素化酶活性分析試劑盒檢測USP48對K-48多聚泛素鏈的水解能力。6.通過免疫印跡法明確USP48、JNK、TNIK對E-鈣黏蛋白蛋白水平的影響;通過實時熒光定量PCR檢測USP48、JNK、TNIK對E-鈣黏蛋白m RNA水平的影響。7.通過細胞-基質(zhì)電阻抗測量技術(shù)檢測USP48、JNK、TNIK對跨上皮細胞電阻抗值的影響。研究結(jié)果1.USP48能夠使TRAF2蛋白穩(wěn)定。1)通過轉(zhuǎn)染Si RNA敲降USP48或轉(zhuǎn)染USP48C98S-V5質(zhì)粒抑制USP48催化活性可明顯減少TRAF2蛋白水平;2)敲降USP48對TRAF2 m RNA水平無影響;3)過表達USP48延長TRAF2蛋白的半衰期。2.USP48去泛素化TRAF2發(fā)生在細胞質(zhì)。1)通過轉(zhuǎn)染USP48-V5質(zhì)粒過表達USP48能夠減少TRAF2蛋白的泛素化水平;2)抑制USP48活性增加TRAF2蛋白的泛素化水平;3)敲降USP48增加TRAF2蛋白K-48位點的多聚泛素化水平;4)USP48和TRAF2在細胞質(zhì)中有共同定位。3.GSK3β調(diào)節(jié)TNFα介導(dǎo)的USP48磷酸化。1)TNFα和GSK3β可以使USP48發(fā)生磷酸化;2)USP48結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有GSK3β的磷酸化區(qū)域;3)抑制GSK3β能夠抑制TNFα介導(dǎo)的USP48磷酸化;4)USP48和GSK3β在細胞質(zhì)有共同定位。4.USP48磷酸化有利于TRAF2蛋白穩(wěn)定。1)抑制GSK3β促進TRAF2蛋白降解;2)抑制GSK3β促進TRAF2蛋白泛素化;3)過表達GSK3βS9A減弱TRAF2蛋白泛素化;4)過表達USP48磷酸化位點失活質(zhì)粒降低TRAF2蛋白穩(wěn)定性;5)過表達USP48磷酸化位點失活質(zhì)粒增加TRAF2蛋白泛素化。5.GSK3β磷酸化USP48增強其去泛素化酶活性。1)抑制GSK3β或過表達USP48磷酸化位點失活質(zhì)粒對TRAF2和USP48之間相互結(jié)合無影響;2)抑制GSK3β削弱USP48去泛素化TRAF2;3)USP48磷酸化位點失活導(dǎo)致其去泛素化酶活性降低;4)GSK3βS9A增強USP48去泛素化酶活性。6.敲降USP48削弱TRAF2介導(dǎo)JNK1激活,進而增加E-鈣黏蛋白表達。1)敲降USP48削弱TNFα介導(dǎo)的JNK1和c-Jun的磷酸化;2)敲降USP48增加E-鈣黏蛋白表達;3)抑制JNK削弱TNFα使E-鈣黏蛋白表達下調(diào);4)抑制TNIK削弱TNFα使E-鈣黏蛋白表達下調(diào);5)敲降USP48削弱TNFα使E-鈣黏蛋白表達下調(diào);6)敲降USP48增加E-鈣黏蛋白m RNA水平;7)抑制JNK或TNIK增加E-鈣黏蛋白m RNA水平。7.敲降USP48或抑制JNK或TNIK增加上皮屏障完整性。1)敲降USP48增加跨上皮細胞電阻抗值;2)抑制JNK或TNIK增加跨上皮細胞電阻抗值;3)敲降USP48促進LPA使跨上皮細胞電阻抗值升高。研究結(jié)論1.GSK3β磷酸化USP48增強其去泛素酶活性,有利于使TRAF2蛋白更穩(wěn)定,促進TNFα使JNK激活;2.下調(diào)USP48僅影響TNFα使JNK激活,對TNFα使NF-κB激活無影響;3.抑制JNK或TNIK能增加E-鈣黏蛋白表達和上皮屏障完整性。4.下調(diào)USP48通過影響JNK,能夠增加E-鈣黏蛋白表達和上皮屏障完整性。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

大連醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文端結(jié)構(gòu)域和 TRAF-C 端結(jié)構(gòu)域, 能夠參與蛋白質(zhì)的寡聚化，以及與其他信號分子之間的相互作用[16-18]。TRAF2 參與調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在 TNFα 的刺激下，TRAF2能夠募集 TNFR1 或 TNFR2，繼而激活 NF-κ B 和 JNK 信號級聯(lián)反應(yīng)[19-22]（圖 1）。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）中的重要分支，JNK 信號通路在TNFα 信號通路中有多重作用，其可以參與介導(dǎo)炎癥、創(chuàng)傷修復(fù)、細胞增殖及細胞凋亡等多種生物學(xué)過程[23-25]。最近有越來越多的證據(jù)表明，JNK 參與調(diào)節(jié) E-鈣黏蛋白介導(dǎo)的上皮細胞之間粘附連接，JNK 通過結(jié)合 E-鈣黏蛋白/β -catenin 復(fù)合體，進而磷酸化 β -catenin 蛋白，參與粘附連接的形成，并控制細胞與細胞之間的粘附[26-28]。但是 TRAF2 是否有直接影響 E-鈣黏蛋白的表達的作用還未曾報道。

大連醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文結(jié)構(gòu)和功能復(fù)合體，屬于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的 種，能夠調(diào)節(jié)靶蛋白的穩(wěn)定性、功能活性狀態(tài)以及細胞內(nèi)定位。泛素化修飾是 個精細調(diào)控的過程，其中有多種酶的參與，包括 E1-泛素活化酶，E2-泛素偶聯(lián)酶和 E3-泛素連接酶。E1-泛素活化酶通過 ATP 水解作用形成高能硫酯鍵將 E1 酶半胱氨酸與泛素分子羧基末端連接在起，以激活泛素；E2-泛素偶聯(lián)酶將 E1 半胱氨酸殘基上結(jié)合的泛素分子轉(zhuǎn)移到E2 活化的半胱氨酸位點；E3-泛素連接酶能夠?qū)⒎核胤肿优c底物蛋白特異性的連接在 起，進而完成泛素化修飾的過程[29-31]（圖 2）。

11圖 3 泛素化修飾及意義[32]去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）可以逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)泛素化的過程，將泛素分子從靶蛋白上水解下來，決定靶蛋白的命運并影響下游的細胞內(nèi)反應(yīng)[39]。去泛素化酶主要有三種功能：第 ，將單個泛素分子從泛素前體中游離下來；第二，將多聚泛素鏈從蛋白酶體上游離下來，循環(huán)利用蛋白質(zhì)降解后釋放出的泛素分子；第三，修飾泛素鏈，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[39-41]。因此，去泛素化酶可以調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性、活性、數(shù)量以及在亞細胞水平的分布，在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮作用�；谌シ核鼗附Y(jié)構(gòu)相似性和作用機制，目前 DUBs 主要分為以下五種類型：泛素特異蛋白酶 (ubiquitin-specific protease，USP)、泛素羧基末端水解酶 (ubiquitin C-terminal hydrolase，UCH)、卵巢腫瘤蛋白酶（Ovarian-tumorprotease, OTU）、Machado-Joseph 疾病蛋白酶（Machado-Joseph disease proteases,

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本文編號：2810705