【摘要】：研究背景腦作為神經(jīng)系統(tǒng)的高級中樞,在控制人體運動,感覺,認(rèn)知,學(xué)習(xí)記憶和情緒等功能上扮演著“指揮官”的角色。然而,隨著人類社會發(fā)展和環(huán)境壓力的不斷增大,焦慮癥、重癥抑郁癥(Major depressive disorder,MDD)、創(chuàng)傷后應(yīng)激綜合癥(post-traumati stress disorder,PTSD)和精神分裂癥等精神疾病患者的數(shù)量在逐年增加。這些精神疾病不僅威脅人類健康,且該類疾病的發(fā)病成年輕化趨勢,為社會和家庭帶來巨大負(fù)擔(dān)。因此,研究與這些疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的病理和生理機(jī)制并尋找有效的藥物靶點和治療方法顯得尤為重要。精神疾病的發(fā)生是基因和環(huán)境雙重因素共同作用的結(jié)果。急性或慢性的環(huán)境應(yīng)激可以誘導(dǎo)精神疾病發(fā)生,尤其是抑郁癥和創(chuàng)傷后應(yīng)激綜合癥,并且這類疾病都是與個體對恐懼記憶的消退障礙有關(guān)。因此,深入了解基因?qū)η榫w行為的調(diào)節(jié)機(jī)制,對于疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。神經(jīng)營養(yǎng)因子家族是神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布且發(fā)揮重要神經(jīng)調(diào)節(jié)作用的蛋白,其中,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophicfactor,BDNF)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布的一種細(xì)胞因子。BDNF的表達(dá)異常與上述所提及疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。例如,B D N F敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的焦慮和抑郁樣行為;同樣,也在長期應(yīng)激和抑郁的動物和人的前額葉、海馬腦區(qū)和外周血中BDNF的表達(dá)均減少。另外,抗抑郁藥物(氟西汀,西酞普蘭,氯胺酮等)可通過促進(jìn)BDNF的合成產(chǎn)生抗抑郁效果。以上結(jié)果說明,BDNF產(chǎn)生降低是導(dǎo)致抑郁發(fā)生的重要因素。因此,闡明調(diào)控BDNF表達(dá)的分子機(jī)制對于揭示精神疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物的研發(fā)有重要意義。BDNF的合成受到轉(zhuǎn)錄、mRNA運輸和翻譯三方面的調(diào)控:(1)在轉(zhuǎn)錄水平上,CREB轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控BDNF基因轉(zhuǎn)錄的主要分子,CREB磷酸化后由胞漿轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核中結(jié)合到啟動子區(qū)促進(jìn)BDNF的轉(zhuǎn)錄;(2)在mRNA運輸水平上,BDNFmRNA的3'UTR具有促進(jìn)mRNA運輸?shù)淖饔?長型的BDNF 3'UTR可幫助BDNF的mRNA運輸?shù)綐渫贿M(jìn)而促進(jìn)突觸形成;(3)在翻譯水平上,HuD蛋白與長型BDNF mRNA的3'UTR結(jié)合能夠促進(jìn)mRNA翻譯。然而,通過調(diào)控BDNF mRNA的5'UTR來調(diào)控其翻譯的機(jī)制目前尚無研究報道。Pdcd4是一種蛋白質(zhì)翻譯抑制因子,它可通過α螺旋結(jié)構(gòu)域MA3與eIF4G競爭性結(jié)合eIF4A,從而抑制核糖體復(fù)合物的形成和蛋白質(zhì)的合成,具有5'UTR選擇性的調(diào)控基因表達(dá)的特點,我們課題組長期從事Pdcd4與疾病的關(guān)系和機(jī)制研究,那么,Pdcd4分子是否調(diào)控BDNF的蛋白表達(dá)參與精神疾病的發(fā)生發(fā)展目前未知。BDNF與膜表面的高親和的酪氨酸激酶受體(Tropomyosin-related kinase B,TrkB)結(jié)合起到促進(jìn)細(xì)胞增殖,分化,神經(jīng)元突起生長和突觸可塑性等作用。BDNF-TrkB的正常作用與腦參與的高級認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān),其參與多種記憶過程,比如記憶形成,鞏固和消退等。研究表明,BDNF與分布于突觸后膜的TrkB受體結(jié)合可以使TrkB發(fā)生磷酸化和二聚化產(chǎn)生激酶活性,激活細(xì)胞內(nèi)MAPK/ERK1/2,PLCy和PI3K三條信號通路,進(jìn)而促進(jìn)AMPA受體上膜和NMDA受體大量開放,參與長時程增強(qiáng)(Long-term potentiation,LTP)產(chǎn)生,從而介導(dǎo)記憶過程。然而,突觸前膜的TrkB是否參與記憶行為目前尚未報道。研究目的目前已知的調(diào)控BDNF表達(dá)和BDNF發(fā)揮作用的形式主要有以下兩個方面:一方面,條件刺激可以調(diào)節(jié)BDNF的表達(dá)和釋放;另一方面,釋放的BDNF與突觸前或后膜分布的受體結(jié)合,通過胞漿內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對刺激進(jìn)行反饋。那么,在精神疾病發(fā)生發(fā)展中,BDNF是如何發(fā)揮作用的呢?本研究就是從這兩方面入手,探究在情緒處理過程中BDNF-TrkB系統(tǒng)是如何發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的。因此,本項目研究主要包括如下兩方面內(nèi)容:一、研究Pdcd4分子調(diào)控BDNF表達(dá)的機(jī)制及其在抑郁行為中的作用;二、探究突觸前BDNF受體TrkB在記憶消退中的作用和機(jī)制。第一部分Pdcd4分子調(diào)控BDNF表達(dá)的機(jī)制及其在抑郁行為中的作用研究方法1.Pdcd4分子參與長期束縛應(yīng)激導(dǎo)致的焦慮抑郁樣行為的研究(1)利用6-8周C57/BL雄性小鼠,建立長期束縛應(yīng)激模型,即置于應(yīng)激管中每天2 h,持續(xù)14天。這種模型可以導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生焦慮和抑郁情緒;(2)利用Western blot方法檢測海馬和前額葉皮層區(qū)在應(yīng)激后Pdcd4分子表達(dá);(3)利用免疫組織化學(xué)方法檢測Pdcd4在應(yīng)激后的表達(dá)情況;(4)對Pdcd4全身性敲除小鼠進(jìn)行長期應(yīng)激后,利用曠場和高架十字迷宮檢測小鼠焦慮行為;利用懸尾,強(qiáng)迫游泳和蔗糖水偏好實驗評價小鼠抑郁樣行為;(5)包裝過表達(dá)Pdcd4的AAV病毒,通過腦立體定位注射入野生型小鼠海馬腦區(qū),再利用行為模型檢測小鼠的焦慮和抑郁行為表現(xiàn)。2.Pdcd4調(diào)控小鼠海馬腦區(qū)神經(jīng)元突觸可塑性和小膠質(zhì)細(xì)胞極化(1)利用高爾基染色方式標(biāo)記神經(jīng)元,觀察Pdcd4敲除小鼠和野生型小鼠在應(yīng)激后海馬腦區(qū)神經(jīng)元樹突的樹突棘數(shù)目變化;(2)過表達(dá)Pdcd4病毒的小鼠腦組織利用GFP抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,觀察GFP陽性神經(jīng)元樹突的樹突棘數(shù)目;(3)免疫組織化學(xué)染色利用Iba1抗體孵育,檢測腦組織中小膠質(zhì)形態(tài)變化。3.Pdcd4調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性的作用受到mTORC1信號調(diào)控(1)通過Western blot方法檢測應(yīng)激后小鼠海馬腦區(qū)mTORC1信號的激活;(2)免疫共沉淀檢測在應(yīng)激的情況下Pdcd4分子的泛素化情況;(3)在建立長期束縛應(yīng)激小鼠模型過程中,給予mTORC1信號的抑制劑雷帕霉素,檢測mTORC1信號標(biāo)志物的磷酸化情況以及Pdcd4分子的變化;(4)利用ELISA方式檢測野生型和Pdcd4敲除小鼠在給予雷帕霉素注射后海馬腦區(qū)BDNF的表達(dá)情況;(5)使用高爾基染色方法觀察給予雷帕霉素注射后小鼠海馬腦區(qū)神經(jīng)元樹突棘數(shù)目變化。4.Pdcd4調(diào)控BDNF的蛋白水平表達(dá)(1)利用RT-PCR檢測應(yīng)激條件下Pdcd4敲除和野生型小鼠BDNFmRNA的表達(dá)情況;(2)利用ELISA檢測應(yīng)激條件下Pdcd4敲除,過表達(dá)和野生型小鼠BDNF蛋白的表達(dá)情況。5.明確Pdcd4調(diào)控BDNF表達(dá)的分子機(jī)制(1)通過RNA-IP實驗證明Pdcd4分子與BDNF的mRNA結(jié)合;(2)構(gòu)建BDNF的5'UTR和3'UTR的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒;(3)利用熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測干擾和過表達(dá)Pdcd4的條件下,各熒光素酶的表達(dá)情況。結(jié)果1.長期束縛應(yīng)激導(dǎo)致Pdcd4特異性在海馬腦區(qū)表達(dá)升高長期束縛應(yīng)激可以導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生焦慮和抑郁樣的行為,為探究這種現(xiàn)象的原因,我們獲得應(yīng)激小鼠和未應(yīng)激小鼠的海馬和前額葉腦區(qū),檢測這兩個腦區(qū)的基因變化,發(fā)現(xiàn)在應(yīng)激小鼠的海馬腦區(qū)Pdcd4分子mRNA和蛋白表達(dá)都有明顯上升,具有統(tǒng)計差異,而在前額葉腦區(qū)則沒有這種變化。我們進(jìn)一步明確了 Pdcd4在腦中的表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)Pdcd4分子在腦中廣泛分布,且主要集中在神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞中,而星形膠質(zhì)細(xì)胞中基本不表達(dá)Pdcd4。2.系統(tǒng)性敲除Pdcd4分子可以抵抗長期應(yīng)激導(dǎo)致的焦慮和抑郁行為產(chǎn)生我們將Pdcd4敲除小鼠和同窩野生型小鼠隨機(jī)分組,分為未應(yīng)激組和應(yīng)激組。通過懸尾實驗,強(qiáng)迫游泳實驗和蔗糖水偏好實驗檢測各組小鼠的抑郁樣行為,通過曠場實驗和高架十字迷宮實驗檢測各組小鼠的焦慮樣行為。我們發(fā)現(xiàn)在未應(yīng)激的情況下,Pdcd4敲除小鼠與野生型小鼠相比沒有差異,而在應(yīng)激的情況下,Pdcd4敲除小鼠與野生型小鼠相比,表現(xiàn)出抵抗應(yīng)激引起的焦慮和抑郁樣行為。3.海馬腦區(qū)特異性過表達(dá)Pdcd4使小鼠表現(xiàn)出自發(fā)的焦慮和抑郁樣行為我們將Pdcd4分子包裝成9型AAV病毒,通過腦立體定位注射的方式定點注射到海馬腦區(qū)。通過行為檢測發(fā)現(xiàn),注射過表達(dá)Pdcd4病毒的小鼠與注射對照病毒的小鼠相比表現(xiàn)出明顯的焦慮和抑郁樣行為,這說明Pdcd4調(diào)控焦慮樣和抑郁樣行為是充分且必要的條件。4.Pdcd4分子通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性、小膠質(zhì)細(xì)胞極化和細(xì)胞因子產(chǎn)生長期束縛應(yīng)激可以導(dǎo)致小鼠海馬腦區(qū)突觸可塑性降低,為探究敲除Pdcd4可以抵抗應(yīng)激引起的焦慮和抑郁樣行為的機(jī)制,我們采用高爾基染色方式標(biāo)記腦中神經(jīng)元形態(tài),發(fā)現(xiàn)應(yīng)激可以引起海馬腦區(qū)神經(jīng)元樹突棘數(shù)目降低,而Pdcd4敲除能夠糾正這種現(xiàn)象。同樣,觀察過表達(dá)Pdcd4小鼠海馬腦區(qū)的神經(jīng)元,則能看到樹突棘的數(shù)目明顯降低。另外,Pdcd4敲除小鼠抵抗CRS誘導(dǎo)的海馬腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞大量活化和增殖,并上調(diào)抑炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)。因此,Pdcd4是調(diào)控神經(jīng)元突觸可塑性和小膠質(zhì)細(xì)胞活化的重要分子。5.mTORC1信號通過調(diào)節(jié)Pdcd4分子影響神經(jīng)元突觸可塑性mTORC1信號是腦中非常重要的調(diào)節(jié)突觸可塑性的信號通路。我們發(fā)現(xiàn)長期束縛應(yīng)激可以通過抑制mTORC1信號激活,進(jìn)而抑制Pdcd4分子的泛素化降解。mTORC1信號調(diào)控神經(jīng)元可塑性是通過調(diào)節(jié)BDNF的表達(dá)實現(xiàn)的,在應(yīng)激情況下進(jìn)一步使用雷帕霉素抑制mTORC1信號后,BDNF的表達(dá)能受到進(jìn)一步的抑制,而Pdcd4敲除能夠阻斷這一下降過程。觀察腦中神經(jīng)元的突觸數(shù)目,與BDNF的表達(dá)變化一致。因此,我們得出結(jié)論,mTORC1信號通過作用于Pdcd4分子調(diào)控BDNF表達(dá)進(jìn)而影響神經(jīng)元突觸可塑性。6.Pdcd4調(diào)控BDNF的轉(zhuǎn)錄后翻譯過程為進(jìn)一步探究Pdcd4分子調(diào)節(jié)BDNF表達(dá)的機(jī)制,我們檢測應(yīng)激情況下,BDNF的mRNA和蛋白的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Pdcd4敲除只可以阻斷應(yīng)激情況下BDNF蛋白的變化,而對mRNA表達(dá)沒有影響。同樣,過表達(dá)Pdcd4可以直接抑制BDNF的蛋白變化。因此,我們明確Pdcd4調(diào)控BDNF是在其轉(zhuǎn)錄后翻譯過程中發(fā)揮作用。7.Pdcd4選擇性抑制llc亞型BDNF mRNA的翻譯BDNF的亞型是由其5'UTR決定的,我們將不同亞型的BDNF構(gòu)建成熒光素酶報告基因質(zhì)粒,檢測在過表達(dá)和敲低Pdcd4的情況下,各個熒光素酶的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pdcd4只針對llc亞型的BDNF具有調(diào)控作用。我們進(jìn)一步將Ⅱc亞型BDNF克隆成與GFP融合蛋白,進(jìn)一步通過檢測GFP的表達(dá)情況反映Pdcd4對llc亞型的BDNF的調(diào)控作用,結(jié)果與報告基因一致。因此,我們得到結(jié)論Pdcd4只針對llc亞型的BDNF進(jìn)行調(diào)控。為了明確Pdcd4調(diào)節(jié)BDNF翻譯的機(jī)制,我們構(gòu)建Pdcd4功能缺失突變體,結(jié)果發(fā)現(xiàn),全長Pdcd4過表達(dá)可以抑制llc BDNF mRNA的表達(dá),而缺失了 RBD-2或兩個MA3區(qū)域的Pdcd4則不能發(fā)揮抑制作用。8.Pdcd4分子通過eIF4A依賴的方式在翻譯水平抑制BDNF蛋白的表達(dá)Pdcd4通過其MA3結(jié)構(gòu)域可以與elF4A結(jié)合,從而抑制eIF4A依賴的蛋白質(zhì)翻譯過程。我們發(fā)現(xiàn),siPdcd4能夠促進(jìn)報告基因表達(dá),而同時轉(zhuǎn)染了 sielF4A后,則阻斷了 siPdcd4促進(jìn)報告基因表達(dá)的作用。因此,我們得出結(jié)論,Ⅱc型BDNF mRNA的翻譯表達(dá)同樣依賴于eIF4A的調(diào)控。9.沉默海馬腦區(qū)Pdcd4表達(dá)能夠預(yù)防和糾正CRS誘導(dǎo)的抑郁行為我們包裝了干擾Pdcd4表達(dá)的siPdcd4慢病毒,分別將病毒在CRS之前和之后注射入小鼠海馬腦區(qū),通過行為檢測觀察降低海馬腦區(qū)Pdcd4的表達(dá)是否對應(yīng)激引起的情緒障礙能夠起到預(yù)防和治療的效果。通過懸尾實驗和強(qiáng)迫游泳實驗,我們發(fā)現(xiàn)無論在CRS之前還是之后注射干擾病毒,與siNC對照組相比,小鼠的不動時間都有顯著降低,表現(xiàn)出抵抗CRS引起的抑郁樣行為的產(chǎn)生;同樣,蔗糖水偏好實驗也證明,在CRS之前或之后注射干擾病毒都能起到糾正CRS引起的糖水偏好度降低的行為。最后,我們通過曠場實驗和高架十字迷宮實驗檢測,在CRS前給予siPdcd4病毒注射能夠抵抗CRS引起的小鼠在中央?yún)^(qū)和開放臂所待時間降低的現(xiàn)象;而在CRS后注射病毒,對CRS引起的焦慮樣行為有部分拯救作用,但是沒有統(tǒng)計學(xué)差異。以上結(jié)果表明,降低Pdcd4分子的表達(dá)對CRS引起的抑郁樣行為能夠起到很好地預(yù)防和治療作用,且能一定程度上預(yù)防焦慮樣行為的產(chǎn)生。結(jié)論1.發(fā)現(xiàn)Pdcd4在調(diào)控抑郁和焦慮樣行為中發(fā)揮重要作用,即Pdcdc4的過表達(dá)促進(jìn)抑郁癥的發(fā)生,敲除或沉默Pdcd4表達(dá)可有效抑制應(yīng)激導(dǎo)致的抑郁的發(fā)生;2.發(fā)現(xiàn)BDNF是Pdcd4新的靶基因,并證明Pdcd4通過elF4A依賴的方式選擇性控制Ⅱc亞型BDNF mRNA的翻譯;3.發(fā)現(xiàn)mTORC1-Pdcd4-BDNF軸在抑郁癥中的重要作用。即mTORC1信號可通過促進(jìn)Pdcd4泛素化降解,控制Pdcd4的表達(dá)水平,而Pdcd4又可通過抑制BDNF的表達(dá),調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性;應(yīng)激通過抑制mTORC1信號的激活,可阻斷Pdcd4的泛素化降解,使其表達(dá)水平升高,升高的Pdcd4進(jìn)而抑制BDNF表達(dá),損傷神經(jīng)可塑性,最終導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生。創(chuàng)新性和意義1.本研究首次提出了 Pdcd4是BDNF轉(zhuǎn)錄后翻譯水平調(diào)控的新分子,對推動Pdcd4作用機(jī)制的研究和弄清BDNF的表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制具有重要的理論意義。2.提出mTORC1-Pdcd4-BDNF軸調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性的新機(jī)制,深化了對于mTORC1信號通路參與焦慮抑郁行為的理解和mTOR調(diào)控BDNF的機(jī)制。3.我們首次發(fā)現(xiàn)在應(yīng)激引起的焦慮和抑郁行為中,Pdcd4是一個關(guān)鍵調(diào)控分子,這為以Pdcd4為藥物靶點、設(shè)計特異性更強(qiáng)的抗抑郁藥提供理論和實驗依據(jù),有重要的應(yīng)用價值。局限性1.在體內(nèi)缺少拯救實驗,來明確Pdcd4就是通過調(diào)節(jié)BDNF的表達(dá)進(jìn)而參與情緒表達(dá)的;2.Pdcd4具體調(diào)節(jié)BDNF的5'UTR哪個區(qū)域還有待進(jìn)一步探究;3.缺少實驗明確Pdcd4調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化的機(jī)制。第二部分突觸前BDNF受體TrkB在記憶消退中的作用和機(jī)制研究方法1.構(gòu)建CC1結(jié)構(gòu)域與EGFP構(gòu)成融合蛋白,體外免疫共沉淀檢測CC1-EGFP抑制TrkB與JIP3的結(jié)合;2.體外培養(yǎng)神經(jīng)元通過活細(xì)胞實驗和免疫熒光實驗定量分析TrkB在軸突的運動和突觸前的分布情況;3.利用FM1-43活體染料標(biāo)記活性突觸前囊泡的方法分析CC1-EGFP是否影響B(tài)DNF引起的突觸前囊泡的釋放;4.利用微流體小室培養(yǎng)神經(jīng)元證明CC1-EGFP是否抑制由突觸前膜TrkB介導(dǎo)的BDNF逆向信號的轉(zhuǎn)導(dǎo);5.將CC1-EGFP包裝成5型AAV病毒,通過腦立體定位注射到大鼠的杏仁核基底外側(cè)核處,利用條件性恐懼記憶模型檢測大鼠的記憶消退情況;6.利用Western Blot方式檢測消退過程中BDNF信號傳導(dǎo)的神經(jīng)環(huán)路。結(jié)果1.TrkB受體順向運輸阻斷型融合蛋白(CC1-EGFP)的制備JIP3分子與TrkB直接結(jié)合介導(dǎo)受體順軸突運輸。CC1結(jié)構(gòu)域來源于JIP3與TrkB結(jié)合的區(qū)域,我們將CC1結(jié)構(gòu)域與EGFP構(gòu)成融合蛋白,通過在HEK293細(xì)胞過表達(dá),利用免疫共沉淀的方式證明CC1-EGFP可以阻斷JIP3與TrkB的結(jié)合。2.CC1-EGFP對TrkB受體在神經(jīng)元軸突末端分布的影響體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,過表達(dá)CC1-EGFP和EGFP后,利用活細(xì)胞成像方式觀察TrkB蛋白在軸突的運輸情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達(dá)CC1-EGFP可以抑制TrkB在軸突上的順向運輸,而對于樹突上的運輸沒有影響。另外,對細(xì)胞內(nèi)源TrkB進(jìn)行免疫熒光染色,CC1-EGFP能夠降低TrkB在軸突末端的分布。以上結(jié)果證明,CC1-EGFP通過抑制TrkB的順軸突運輸使其在軸突末端分布降低。3.CC1-EGFP對突觸前TrkB介導(dǎo)的BDNF功能的影響突觸前TrkB可以介導(dǎo)BDNF引起的突觸前囊泡釋放。因此,我們利用FM1-43活體染料標(biāo)記活體囊泡,通過活細(xì)胞成像實驗觀察在BDNF處理前后神經(jīng)元囊泡的釋放情況。通過統(tǒng)計可以發(fā)現(xiàn),過表達(dá)CC1-EGFP能夠阻斷BDNF促進(jìn)囊泡釋放的功能。另一方面,突觸前TrkB也可以介導(dǎo)BDNF引起的TrkB信號從末端向胞體的逆向信號傳遞。我們利用微流體小室培養(yǎng)神經(jīng)元,在軸突末端加入BDNF刺激后發(fā)現(xiàn),CC1-EGFP能夠抑制Erk5在胞體的激活,而在胞體側(cè)加入BDNF刺激CC1-EGFP則對胞體的Erk5激活沒有影響。因此,我們得到結(jié)論CC1-EGFP能夠抑制BDNF引起的突觸囊泡釋放和TrkB逆向信號傳遞。4.杏仁核基底外側(cè)核腦區(qū)過表達(dá)CC1-EGFP阻斷TrkB順向運輸對記憶消退的影響為了研究突觸前TrkB對行為的影響,將CC1-EGFP包裝成5型AAV病毒,并且采用Camkllα啟動子引導(dǎo)其表達(dá),使其能夠選擇性的在長距離投射的神經(jīng)元中表達(dá)。我們將病毒注射到與消退相關(guān)的大鼠杏仁核基底外側(cè)核處,通過對大鼠進(jìn)行條件性恐懼記憶獲得訓(xùn)練和消退訓(xùn)練后,發(fā)現(xiàn)CC1-EGFP過表達(dá)能夠抑制記憶消退。結(jié)果說明,突觸前TrkB參與記憶消退過程。5.CC1-EGFP能夠抑制BDNF信號從基底外側(cè)核向內(nèi)側(cè)前額葉皮層的傳遞為探究突觸前TrkB調(diào)控記憶消退的作用,我們檢測了基底外側(cè)核和內(nèi)側(cè)前額葉皮層的TrkB激活情況,進(jìn)而反映BDNF信號激活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),消退訓(xùn)練可以激活這兩個腦區(qū)的TrkB,而CC1-EGFP則抑制內(nèi)側(cè)前額葉腦區(qū)的TrkB激活。因此,猜測CC1-EGFP是抑制了 BDNF信號從基底外側(cè)核的傳出而導(dǎo)致的這一現(xiàn)象。我們將BDNF與病毒同時注射在基底外側(cè)核,檢測內(nèi)側(cè)前額葉區(qū)域TrkB的激活情況,發(fā)現(xiàn)與我們猜測一致,CC1-EGFP可以抑制BDNF信號從基底外側(cè)核向內(nèi)側(cè)前額葉區(qū)的傳遞。綜上所述,突觸前TrkB參與消退記憶中BDNF傳遞的信號傳遞環(huán)路。結(jié)論1.制備了 TrkB受體順向運輸阻斷型融合蛋白(CC1-EGFP),建立了以CC1-EGFP為工具研究突觸前TrKB信號通路作用的系統(tǒng);2.利用CC1-EGFP這種工具蛋白研究杏仁核區(qū)突觸前TrkB在記憶消退中的作用;3.明確突觸前TrkB通過調(diào)節(jié)BDNF信號從杏仁核基底外側(cè)區(qū)向內(nèi)側(cè)前額葉腦區(qū)傳遞的信號環(huán)路參與記憶消退。創(chuàng)新性和意義我們首次證明了基底外側(cè)杏仁核神經(jīng)元的突觸前TrkB參與記憶消退過程,使人們更加了解消退記憶形成的機(jī)制,為以后操縱記憶提供可能。局限性1.該課題并沒有研究突觸前TrkB調(diào)節(jié)記憶消退是否是充分條件;2.我們只證明基底外側(cè)杏仁核神經(jīng)元的突觸前TrkB參與記憶消退,并沒有證明其他與消退相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元突觸前TrkB是否參與記憶調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R338
【圖文】：

動物實驗也證實，將嚙齒動物暴露于應(yīng)激的環(huán)境中會使動物產(chǎn)生了類似抑郁癥的逡逑癥狀，同樣也發(fā)現(xiàn)ＰＦＣ與海馬腦區(qū)中神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞萎縮和突觸喪失，逡逑而抗抑郁藥治療可以部分挽救這種情況（如圖１所示）。臨床前和臨床研究表明，逡逑神經(jīng)元突觸可塑性的損傷是抑郁癥的病理基礎(chǔ)［６’邋７］。雖然神經(jīng)T塑性損傷與抑郁逡逑癥存在相關(guān)，但確切的機(jī)制尚未完全了解。逡逑２３逡逑

小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化，細(xì)胞的形態(tài)和功能發(fā)生改變使其與神經(jīng)元的接逡逑觸增加，也可通過釋放更多的促炎性細(xì)胞因子，降低抑炎性細(xì)胞因子或ＢＤＮＦ逡逑的釋放損傷神經(jīng)元突觸可塑性，導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生（如圖２所示）。因此，調(diào)控逡逑小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和功能成為抗抑郁治療的一個重要策略。逡逑Ｓｔｒｅｓｓ邋Ｄｕｒａｔｉｏｎ邋—邐——邋—？逡逑Ｅｘｔｒａｓｙｎａｐｔｉｃ逡逑ｉ邋＼＼邋ｙ邐Ｊ＼邋ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ邋＼Ａ＼／逡逑ｙ邋ｉ邐（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ；邋ＮＥ；ＧＡＢＡ）＾＼（＾逡逑｜邋ｔ邋ｎｅｕｒｏｎａｌ邐Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ邐Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ邋ａｔｒｏｐｈｙ逡逑｛邋ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邐Ｆａｃｔｏｒｓ邐ａｎｄ邋ｒｅｄｕｃｅｄ逡逑（ｃＦ0ｓ，邋ＦｏｓＢ）邐%煎澹ǎ悖常悖歟椋╁危紓歟酰簦幔恚幔簦邋澹潁澹悖澹穡簦錚潁簀義希殄澹停錚潁穡瑁錚歟錚紓椋悖幔戾褰皰危睿媯В耄洛巍澹校瑁幔紓錚悖簦椋沐義希苠澹幔歟簦澹潁幔簦椋錚睿簀澹幔睿溴濉鰣巍鰣澹穡幔簦瑁鰨幔簀義希苠澹穡潁錚歟椋媯澹潁幔簦椋錚鑠危ǎ荊歟叮誨澹簦睿媯錚誨澹歟椋校╁危隋義希苠澹皺危蓿蓿桑睿媯歟幔恚恚幔螅錚恚邋義希殄危掊危幔悖簦椋觶幔簦椋錚鑠義希ǎ危蹋遙校常

本文編號：2810692