吸煙對人體健康的危害已眾所周知。據(jù)統(tǒng)計,每年因為吸煙造成的死亡人數(shù)可達250萬人之多,吸煙已成為人們所公認的危害人體健康極其重要的因素。相關研究表明,吸煙會導致機體內巨噬細胞的堵塞,使巨噬細胞吞噬及遷移的能力降低,從而降低機體抗感染的能力。巨噬細胞作為人體的免疫細胞,參與人體多種疾病的發(fā)病過程,因此近年來巨噬細胞也被作為疾病治療的主要靶標,研究者們試圖通過對其功能的調控,使病情得到改善。細胞膜受體蛋白Integrins通過與胞內骨架蛋白的相互作用來介導細胞與胞外基質的黏著,參與了細胞的遷移及吞噬過程。因此本課題旨在通過研究尼古丁對巨噬細胞的功能、整合蛋白Integrins及細胞外間充質蛋白FNs家族蛋白在巨噬細胞中的表達的影響,試圖闡明影響巨噬細胞功能的相關分子機制,為巨噬細胞相關疾病的預防和治療提供一個細胞活體水平的重要資料。本課題以原代巨噬細胞和小鼠巨噬細胞系RAW264兩種細胞培養(yǎng)模型為研究對象,利用尼古丁對細胞進行藥物干預,通過高內涵活細胞成像分析系統(tǒng)在活細胞水平上檢測尼古丁對巨噬細胞形態(tài)及功能方面的影響;采用免疫熒光染色、掃描電鏡對Integrins蛋白及FNs蛋白進行定位分析;利用廣譜試劑盒檢測多種整合素蛋白在細胞表面的表達結合;Elisa方法檢測分析在RAW264細胞中不同的Integrins與FN-α蛋白間的相互作用;通過Western Blot技術從蛋白水平檢測尼古丁對Integrins蛋白和FNs蛋白在巨噬細胞中表達的影響;利用實時熒光定量PCR方法從mRNA水平檢測Integrins蛋白在巨噬細胞中的表達。結果顯示如下:(1)高內涵分析結果顯示:在常規(guī)培養(yǎng)皿上,尼古丁使原代巨噬細胞的運動速度及距離降低,長度和面積減小,運動角度發(fā)生變化;在ECM基質環(huán)境中,原代巨噬細胞的面積及長度在尼古丁處理后增大,運動的距離減小,細胞運動的速度在不同的作用時間存在一定的差異;小鼠巨噬細胞系RAW264細胞的面積、長度、運動速度及距離均在尼古丁作用不同時間之間存在顯著差異。原代巨噬細胞和RAW264細胞的運動轉角在ECM培養(yǎng)環(huán)境中均無顯著性差異。(2)免疫熒光及掃描電鏡結果顯示:Integrins蛋白呈點狀分布在巨噬細胞的偽足,FN-α蛋白也呈點狀分布在細胞的遷移軌跡及細胞的偽足上。該兩種蛋白具有一定的共定位現(xiàn)象,在尼古丁作用后,Integrinβ1、Integrinαv及FN-α蛋白的表達量均有一定程度的減少。(3)Integrins及FNs表達模式檢測結果顯示:在RAW264細胞中,Integrin α2、Integrin α5、Integrin β1及Integrin β2四種蛋白具有一個相對較高的表達量,且Alpha Integrin 和 Beta Integrin 存在一定程度的相關性。而 Integrin α3、Integrin α5、Integrinβ1和Integrin β4該四種蛋白與FN-α蛋白具有一個較強的相互作用。(4)WesternBlot結果表明:在尼古丁作用36h時,Integrinβ1蛋白呈顯著的上調,到72 h逐漸下調;Integrin αv蛋白在尼古丁作用0 h到36 h逐漸下調,48 h時呈顯著上調;FN-3蛋白在尼古丁作用24 h時表達量下調;FN-4蛋白在24 h和48 h時表達量上調,72 h后顯著下調;FN-F蛋白在尼古丁作用24 h時呈顯著的下調,之后表達量相對穩(wěn)定,72 h后又下調。(5)實時熒光定量PCR結果顯示:Integrin β1蛋白在尼古丁作用24 h和48 h時表達量上調,72h后下調(P0.001);Integrinαv蛋白在24h和36h時表達量上調,之后趨于穩(wěn)定。結論:本課題利用高內涵活細胞成像分析系統(tǒng)、免疫熒光染色技術、掃描電鏡技術、Integrins表達模式檢測、Elisa、Western Blot和實時熒光定量PCR方法從細胞、蛋白及mRNA水平上探討尼古丁對巨噬細胞行為及功能的影響,以及Integrins和FNs兩種蛋白在巨噬細胞中功能改變的作用機制。結果表明該兩種蛋白可能參與調控巨噬細胞的遷移過程,并具有一定的相關性,可為巨噬細胞相關疾病的治療提供細胞水平的重要資料。
【學位單位】：陜西師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

為了檢測尼古丁對原代巨噬細胞動態(tài)及行為的影響，我們利用高內涵進行活逡逑細胞追蹤，并采用高內涵傳統(tǒng)分折方法分別對尼古丁處理前后原代巨噬細胞的動逡逑態(tài)及行為變化進行分析。尼古丁處理前后原代巨噬細胞運動軌跡的變化如圖３－１逡逑所示，在尼古丁處理之后，原代巨噬細胞的運動有明顯被抑制的現(xiàn)象（圖３－１邋Ｂ）。逡逑尼古丁處理前后形態(tài)及動態(tài)變化分析如圖３－２所示，尼古丁處理后與對照組相比細逡逑胞的面積顯著減�。ǎ穑迹埃埃埃保�，細胞的長度顯著變短（Ｐ０．００１）（圖３－２邋Ａ和Ｄ）；逡逑細胞運動的距離和運動的速度相比對照組細胞也呈現(xiàn)顯著的縮短和減慢（Ｐ０．００１）逡逑（圖３－２邋Ｂ和Ｅ）；細胞運動的轉角角度與對照組相比也具有極顯著的差異逡逑（Ｐ０．００１）（圖邋３－２Ｃ）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑ｒ—，邐Ｂｅｆｏｒｅ邋Ｎｉｃ邐—邋Ａｆｔｅｒ邋Ｎｉｃ逡逑ｉ：｜S茫椋海昵劐義希靛危危危溴義希玻ǎ

本文編號：2810604