【摘要】：生物膜上所包含的蛋白質(zhì)統(tǒng)稱膜蛋白,膜蛋白是細(xì)胞與周圍環(huán)境之間進(jìn)行物質(zhì)交換和維系細(xì)胞生理功能的關(guān)鍵成分,執(zhí)行許多重要的生物功能,如信號(hào)的識(shí)別與轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子交換、物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的維護(hù)等。大多數(shù)膜蛋白不同程度地嵌入脂質(zhì)雙分子層中,其膜內(nèi)部分由一些非極性氨基酸組成,與膜緊密結(jié)合;膜外部分則由極性較高的親水性氨基酸組成。雖然傳統(tǒng)的非離子性表面活性劑SDS可以使多數(shù)膜蛋白變性溶解,但SDS在后續(xù)樣品處理過(guò)程中不容易除去,抑制質(zhì)譜的離子響應(yīng),反而不利于肽段的檢出;而非離子表面活性劑Triton-X的臨界膠束濃度(CMC)較低,單獨(dú)使用對(duì)于膜蛋白的溶解并不理想。本文建立了基于TM-PEK試劑盒提取、nanoLC-MS/MS分析鑒定大鼠腦顳葉皮層膜蛋白的方法。對(duì)比分析了TM-PEK試劑盒中的兩種提取緩沖液(提取緩沖液2A和提取緩沖液2B)對(duì)乳鼠和成年大鼠腦顳葉皮層膜蛋白的抽提效果。孕期及哺乳期的女性的機(jī)體狀態(tài)一直是深受關(guān)注的話題。孕期和哺乳期女性與正常時(shí)期的女性相比,在行為和生理方面發(fā)生明顯變化,有許多獨(dú)特的現(xiàn)象和規(guī)律,涉及一系列蛋白質(zhì)合成、降解和磷酸化等狀態(tài)的動(dòng)態(tài)改變。SD大鼠生長(zhǎng)快,繁育性能好,經(jīng)常用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、藥物安全性評(píng)價(jià)、生命科學(xué)及生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)研究,是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中最常用的品種之一。理論上講,在懷孕期和哺乳期整個(gè)過(guò)程中,大鼠的海馬和腦顳葉皮層與正常老鼠相比會(huì)產(chǎn)生很大的差異。本研究旨在采用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tags,TMT)標(biāo)記技術(shù)比較孕晚期及哺乳期末SD大鼠與正常大鼠海馬/腦顳葉皮層表達(dá)蛋白的差異。第一部分乳鼠及成年大鼠腦顳葉皮層膜蛋白組學(xué)分析方法的建立目的:建立基于Novagen ProteoExtract提取、Nano LC-MS/MS鑒定Sprague-Dawley大鼠腦顳葉皮層膜蛋白的組學(xué)方法,并用本法研究大鼠乳鼠及成年鼠大腦皮層的差異膜蛋白。方法:分離大鼠大腦皮層后,通過(guò)Novagen Proteo Extract跨膜蛋白抽提試劑盒(簡(jiǎn)稱TM-PEK)中的不同提取液(提取緩沖液2A與提取緩沖液2B)抽提蛋白,經(jīng)Filter Aided Proteome Preparation(FASP)酶解、Nano LC分離、Orbitrap Fusion高分辨質(zhì)譜采集數(shù)據(jù),通過(guò)Proteome Discover軟件解析所提取到的蛋白,并對(duì)這些蛋白的疏水性、跨膜情況及生物信息學(xué)進(jìn)行分析。結(jié)果:1.兩種膜蛋白提取液的Nano LC-MS/MS鑒定結(jié)果如下,根據(jù)Proteome Discoverer 2.1軟件搜庫(kù),提取緩沖液2A共鑒定出489個(gè)蛋白,1108個(gè)PMSs(Peptide matched spectra)。提取緩沖液2B共鑒定出2590個(gè)蛋白,8322個(gè)PMSs。2.兩種提取液提取蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)結(jié)果如下,大部分被鑒定蛋白的MW分布在20-40 kDa的范圍之間,pI分布在5-7和8-9的范圍之間。與提取緩沖液2A相比,提取緩沖液2B鑒定的蛋白廣泛分布于各MW和pI組中;提取緩沖液2A和提取緩沖液2B所鑒定GRAVY值為正值的蛋白數(shù)量分別是30(6%)和272(11%)個(gè)。與提取緩沖液2A相比,提取液2B對(duì)不同疏水性蛋白有更高的鑒定效率。兩種提取液所抽提蛋白的TMDs分布有明顯區(qū)別,提取緩沖液2B抽提出含有更多跨膜區(qū)域的蛋白,尤其是TMDs14的蛋白只在提取緩沖液2B中存在。與提取緩沖液2A相比,提取緩沖液2B更適用于酶解和鑒定含有高度疏水性多重跨膜區(qū)域的蛋白。3.2A提取溶液提取并鑒定到的成年SD大鼠的膜蛋白數(shù)量(1233個(gè))明顯多于乳鼠的膜蛋白(277個(gè))。KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析顯示,成年SD大鼠的蛋白富集到蛋白酶體(proteasome,P=1.2E~(-21))、突觸囊泡循環(huán)(synaptic vesicle cycle,P=4.0E~(-13))、碳代謝(carbon metabolism,P=1.6E~(-13))通路和丙酮酸代謝(pyruvate metabolism P=7.0E~(-8))通路;而乳鼠的蛋白則富集到剪接體(spliceosome,P=3.4E~(-11))、核糖體(ribosome,P=1.7E~(-6))通路中。4.2B提取溶液鑒定到的成年SD大鼠的膜蛋白數(shù)量為1679個(gè),乳鼠的膜蛋白為1708個(gè)。KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析顯示,成年鼠的蛋白富集到GABA氨基丁酸突觸(GABAergic synapse,P=2.6E~(-7))、谷氨酸能突觸(glutamatergic synapse,P=8.0E~(-7))及多巴胺能突觸(dopaminergic synapse,P=1.8E~(-5))。乳鼠蛋白則富集于RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(RNA transport,P=4.4E~(-14))、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(protein processing in endoplasmic reticulum,P=7.0E~(-6))、真核細(xì)胞的核糖體生物合成(ribosome biogenesis in eukaryotes,P=6.0E~(-4))等與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的通路中。結(jié)論:本研究建立了基于TM-PEK試劑盒提取、nanoLC-MS/MS分析鑒定大鼠皮層膜蛋白的方法,并研究了大鼠乳鼠及成年鼠皮層的差異膜蛋白,成年鼠以突觸為代表的細(xì)胞間的聯(lián)系發(fā)生了顯著變化,而乳鼠蛋白的合成較成年鼠旺盛。第二部分孕晚期和哺乳期末大鼠腦顳葉皮層和海馬膜蛋白差異的分析目的:本實(shí)驗(yàn)采用Percoll密度梯度離心法制備膜蛋白建立Nano LC-MS/MS鑒定Sprague-Dawley大鼠孕晚期和哺乳期末腦顳葉皮層和海馬的組學(xué)方法,并用本法研究SD大鼠孕晚期和哺乳期末腦顳葉皮層和海馬的差異蛋白。方法:制備大鼠的膜蛋白,使用TMT(Tandem Mass Tags)對(duì)蛋白進(jìn)行定量標(biāo)記。經(jīng)Orbitrap Fusion高分辨質(zhì)譜采集數(shù)據(jù),通過(guò)Proteome Discover軟件解析所提取到的蛋白,并對(duì)差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果:1.在孕海馬組差異蛋白與乳海馬組差異蛋白中,236個(gè)蛋白在兩組差異蛋白中均存在,439個(gè)差異蛋白只存在于孕海馬組,1007個(gè)差異蛋白只存在于乳海馬組。在孕皮層組差異蛋白與乳皮層組差異蛋白中,318個(gè)蛋白在兩組差異蛋白中均存在,930個(gè)差異蛋白只存在于孕皮層組,558個(gè)差異蛋白只存在于乳皮層組。2.海馬差異蛋白的KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析顯示,孕海馬組差異蛋白主要參與的通路有氧化磷酸化通路(oxidative phosphorylation,P=7.83E~(-21)),乳海馬組差異蛋白主要參與的通路包括催產(chǎn)素信號(hào)通路(oxytocin signaling pathway,P=6.78E~(-4))、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂(oocyte meiosis,P=0.003)和胚胎與器官發(fā)育信號(hào)通路(wnt signaling pathway,P=0.006)。3.腦皮層差異蛋白的KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析顯示,孕皮層組差異蛋白主要參與的通路包括雌激素信號(hào)通路(estrogen signaling pathway,P=1.03E~(-4))和催產(chǎn)素信號(hào)通路(oxytocin signaling pathway,P=0.005),乳皮層組差異蛋白主要參與的通路包括孕酮調(diào)節(jié)的卵母細(xì)胞成熟通路(progesterone-mediated oocyte maturation,P=0.005)和催乳素信號(hào)通路(prolactin signaling pathway,P=1.43E~(-4))。結(jié)論:孕晚期和哺乳末期的海馬/腦顳葉皮層的差異蛋白存在很大的差別,孕晚期腦顳葉皮層中表達(dá)更多的與雌激素信號(hào)通路的相關(guān)蛋白;哺乳末期的海馬組織中表達(dá)更多的與催產(chǎn)素、胚胎與器官發(fā)育信號(hào)通路的相關(guān)蛋白,哺乳末期腦顳葉皮層中則表達(dá)更多的與催乳素信號(hào)通路的相關(guān)蛋白。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R338
【圖文】：

膜蛋白提取流程

圖 4 比較基于兩種不同提取緩沖液抽提的膜蛋白的分布 （A） 分子量（MW）; （B） 等電點(diǎn)（pI）; （C） 平均疏水性（GRAVY）; （D）預(yù)測(cè)的跨膜區(qū)域（TMD）Fig.4 Comparison of the distribution of membrane proteins identified based ontwodifferent extraction buffers (A): Molecular weight (MW); (B): Isoelectricpoint (pI); (C): Grand average of hydropathy value (GRAVY); (D): Predictedtransmembrane domains (TMDs)

25圖 5 比較基于兩種不同緩沖提取液抽提的膜蛋白的 GO 分析 （A）定位；（B）分子功能；（C）生物學(xué)過(guò)程Fig.5 The GO analysis of cortex membrane proteins in rat cerebral cortecompared between two different extractions (A): Cellular component；Molecular function；(C): Biological processing

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳富美;付強(qiáng);王煥景;趙秀靈;黃德倫;黃愉淋;潘宏;黃鳳玲;張明;;利用TMT標(biāo)記結(jié)合2DLC-MS/MS技術(shù)對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟前后差異蛋白質(zhì)組的分析[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2015年09期

2 常乘;朱云平;;基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)策略和方法研究進(jìn)展[J];中國(guó)科學(xué):生命科學(xué);2015年05期

3 弓青霞;宋揚(yáng);劉佳;王麗穎;金作林;;應(yīng)用Label-free技術(shù)研究人牙囊細(xì)胞和牙周膜成纖維細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2015年05期

4 余慶邦;范明;王曉稼;鄭智國(guó);許沈華;陳占紅;厲力華;;基于SELDI-TOF蛋白質(zhì)譜分析的乳腺癌TNM分期研究[J];生物醫(yī)學(xué)工程研究;2015年01期

5 張磊;尹紅銳;張瑩;陸豪杰;;基于生物質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J];分析測(cè)試技術(shù)與儀器;2014年03期

6 陳凌聲;徐平;石德順;李湘萍;;哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞及早期胚胎蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J];生物工程學(xué)報(bào);2014年07期

7 俞飛;于敏;陳維忠;肖飛;;妊娠期婦女心理狀況及保健需求調(diào)查分析[J];中國(guó)婦幼保健;2014年02期

8 周愿;單亦初;張麗華;張玉奎;;基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法研究進(jìn)展[J];色譜;2013年06期

9 武鵬;賀福初;姜穎;;定量蛋白質(zhì)組學(xué)無(wú)標(biāo)記定量方法的研究進(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2013年03期

10 陳瑜;李嬌陽(yáng);李茂玉;肖志強(qiáng);;不同轉(zhuǎn)移潛能鼻咽癌細(xì)胞株的差異膜蛋白質(zhì)組研究[J];國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志;2012年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 栗冬梅;漢賽巴爾通體外膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2009年

本文編號(hào)：2804033