發(fā)布時(shí)間：2020-08-25 17:11

【摘要】：小鼠免疫系統(tǒng)與人類(lèi)免疫系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)以及功能上非常相似,因此研究人員利用小鼠模型深入的研究了人體免疫系統(tǒng)的相關(guān)功能。但是,由于種屬特異性的存在,在疾病致病機(jī)制、病原感染等方面,小鼠產(chǎn)生的免疫反應(yīng)過(guò)程與人體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)過(guò)程差異顯著。其中一個(gè)原因是MHC限制性差異,人類(lèi)MHC分子為HLA,小鼠MHC分子為H-2。由于無(wú)法消除小鼠與人類(lèi)間不同的特異性而導(dǎo)致的影響,因此很多基礎(chǔ)研究中,無(wú)法有效地反映人體免疫系統(tǒng)的特征,進(jìn)而影響臨床實(shí)驗(yàn)研究,無(wú)法復(fù)制臨床前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的結(jié)果。而構(gòu)建能夠模擬人體免疫反應(yīng)的人源化小鼠,可更有效的幫助人們了解疾病的致病機(jī)制以及疫苗、藥物的研究,并提高臨床前實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。MHC分子具有高度的多態(tài)性,同時(shí)各人群優(yōu)勢(shì)單倍型也有特征性分布,因此也導(dǎo)致了人群中各種各樣的個(gè)體存在,為了抵御環(huán)境變化和病原入侵,某一群體會(huì)有相同或相似的MHC分子。這樣導(dǎo)致某一種族,某一群體中MHC優(yōu)勢(shì)基因不盡相同,有著明顯的差異。中國(guó)人群中,MHC-I類(lèi)分子中,HLA-A2、HLA-A11和HLA-A24是優(yōu)勢(shì)亞型,但是歐洲人群以HLA-A2、HLA-A3和HLA-A1為主。在MHC-II類(lèi)單倍型中,HLA-DR15在中國(guó)人群中占25%以上,HLA-DR1單倍型在中國(guó)人群中占的比例在10%~15%。而歐洲人群以及中東地區(qū)人群中,HLA-DR1、HLA-DR3和HLA-DR4為優(yōu)勢(shì)存在的單倍型。目前構(gòu)建的人MHC轉(zhuǎn)基因小鼠模型的策略是將外源HLA基因整合入小鼠基因組后,同時(shí)敲出小鼠內(nèi)源的H-2基因的重要組分。此種策略構(gòu)建的MHC轉(zhuǎn)基因小鼠模型具有人MHC限制性反應(yīng)特征,能夠有效的應(yīng)用于人類(lèi)病原表位的篩選鑒定以及疫苗研發(fā)和評(píng)價(jià)等研究中。埃博拉病毒是一類(lèi)絲狀病毒,在人類(lèi)和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中都會(huì)導(dǎo)致高死亡率的烈性傳染病。2014年非洲地區(qū)發(fā)生埃博拉病毒最大規(guī)模的一次疫情暴發(fā)。盡管?chē)?guó)內(nèi)外已經(jīng)進(jìn)行了大量摸索及研究,但仍沒(méi)有有效的治療方法或臨床應(yīng)用的抗埃博拉病毒的疫苗。近年來(lái),隨著科學(xué)家們對(duì)埃博拉病毒蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究,發(fā)現(xiàn)埃博拉病毒核蛋白是病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白之一,其在病毒復(fù)制和包裝過(guò)程有重要作用,而且具有感染免疫保護(hù)作用�；诎２├《竞说鞍�,結(jié)合生物信息技術(shù)分析、預(yù)測(cè)和鑒定病毒表位,設(shè)計(jì)多肽表位疫苗,這也是病毒疫苗研發(fā)的新的技術(shù)途徑之一。本論文首先是構(gòu)建一種新型具有中國(guó)人群優(yōu)勢(shì)HLA-I類(lèi)和HLA-II類(lèi)單倍型的HLA-A2/DR15雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型,并以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的具有中國(guó)人群優(yōu)勢(shì)HLA-I類(lèi)及HLA-II類(lèi)單倍型的HLA-A11/DR1雙轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行埃博拉病毒核蛋白HLA-A11限制性CTL表位的篩選和鑒定研究。1.人MHC(HLA-A2/DR15)雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型制備及功能分析將鼠源H-2-Iaβ的啟動(dòng)子和非編碼區(qū)替換HLA-DRB1*15:01基因的啟動(dòng)子和非編碼區(qū),優(yōu)化后的HLA-DRB15轉(zhuǎn)基因載體顯微注射將其整合到受體小鼠的基因組后,移植胚胎到代孕母鼠體內(nèi),獲得HLA-DRB15首建鼠。將首建鼠與HLA-A2~(+/+)/DR1~(+/+)/H-β2m~(-/-)/IAβ~(-/-)雙轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交,并通過(guò)10代以上的自交和回交,獲得可穩(wěn)定遺傳的HLA-A2~(+/+)/DR15~(+/+)/H-2-β2m~(-/-)/IAβ~(-/-)雙轉(zhuǎn)基因小鼠。通過(guò)基因檢測(cè)HLA-A2基因和HLA-DR15基因在轉(zhuǎn)小鼠模型基因組中表達(dá),以及鼠源H-2基因的表達(dá)沉默;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HLA-A類(lèi)基因和HLA-DR類(lèi)基因在HLA-A2/DR15雙轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞表面的表達(dá)明顯高于對(duì)照組C57BL/6小鼠中的表達(dá);并且,在雙轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)也檢測(cè)到了相對(duì)正常比例和數(shù)量的CD8~+T細(xì)胞和CD4~+T細(xì)胞,表明外源HLA分子能夠在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi),經(jīng)過(guò)胸腺的陰性和陽(yáng)性的選擇,進(jìn)而發(fā)育成為成熟的T細(xì)胞后,行使其相應(yīng)細(xì)胞免疫功能。利用構(gòu)建的重組腺病毒Ad5-EBOV-NP分別免疫HLA-A2/DR15雙轉(zhuǎn)基因小鼠或?qū)φ战MC57BL/6小鼠,三次免疫后發(fā)現(xiàn),HLA-A2/DR15雙轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的IgG抗體水平與對(duì)照組C57BL/6小鼠體內(nèi)的抗體水平基相近,證明雙轉(zhuǎn)基因小鼠具有相對(duì)正常的體液免疫反應(yīng)應(yīng)答。通過(guò)生物信息學(xué)分析合成9個(gè)HLA-DR15限制性Th表位肽,其中AL-15、KA-15、FV-15、KS-15、YN-15和HA-15刺激免疫后的HLA-A2/DR15雙轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞可產(chǎn)生大量IFN-γ,顯著強(qiáng)于免疫后的野生型小鼠產(chǎn)生的IFN-γ,證明該轉(zhuǎn)基因小鼠具有HLA-DR15限制性細(xì)胞免疫應(yīng)答功能。以上結(jié)果表明,本研究成功制備了一種具有中國(guó)人群優(yōu)勢(shì)MHC限制性特征的HLA-A2/DR15雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型。該模型可用于病原抗原HLA-DR15限制性表位的篩選鑒定、疫苗藥物的研發(fā)以及疾病致病機(jī)制等研究。2.埃博拉病毒核蛋白HLA-A11限制性CTL表位篩選與鑒定本研究以埃博拉病毒核蛋白基因?yàn)檠芯繉?duì)象,合成EBOV-NP基因序列,將其克隆到穿梭載體pShuttle-CMV中,線性化的穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BJ5183感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)而重組到腺病毒系統(tǒng)的骨架質(zhì)粒中。利用Pac I限制性?xún)?nèi)切酶酶切后,轉(zhuǎn)染到AD-293包裝細(xì)胞內(nèi)�；谙俨《鞠嚓P(guān)的細(xì)胞病變效應(yīng)鑒定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,然后將重組Ad5-EBOV-NP病毒在AD-293細(xì)胞中再擴(kuò)增并純化。為了檢測(cè)重組病毒的表達(dá),用純化的Ad5-EBOV-NP制備物感染AD-293細(xì)胞并在熒光顯微鏡下觀察,以及用Western Blot方法可檢測(cè)到EBOV-NP蛋白表達(dá)。利用重組腺病毒Ad5-EBOV-NP分別免疫HLA-A11/DR1轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型C57BL/6。每次免疫后收集血清,利用ELISA方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)IgG抗體應(yīng)答。結(jié)果顯示,三次免疫后,Ad5-EBOV-NP分別免疫轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的抗體水平與對(duì)照組C57BL/6小鼠體內(nèi)的抗體水平無(wú)顯著差異;而Ad5-EBOV-NP免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的抗體滴度顯著高于對(duì)照重組腺病毒Ad5免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的滴度。同時(shí),利用生物信息技術(shù)分析和預(yù)測(cè)了EBOV-NP蛋白的HLA-A11限制性表位肽,基于預(yù)測(cè)的HLA-A11結(jié)合程度和常規(guī)疏水性,合成10個(gè)結(jié)合力較高的表位肽。分別用Ad5-EBOV-NP或Ad5免疫HLA-A11/DR1雙轉(zhuǎn)基因小鼠,利用ELISPOT方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)10個(gè)多肽中有6個(gè)多肽,即GR-9、VR-9、QR-9、EK-9、PK-9和RK-9可誘導(dǎo)Ad5-EBOV-NP免疫小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生的大量IFN-γ,比Ad5免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)脾細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ高4倍以上。進(jìn)一步驗(yàn)證得到的6個(gè)表位是HLA-A11限制性的T細(xì)胞表位,用Ad5-EBOV-NP分別免疫HLA-A11/DR1或C57BL/6小鼠發(fā)現(xiàn),其中GR-9、VR-9、EK-9、PK-9和RK-9這5個(gè)多肽可刺激Ad5-EBOV-NP免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生顯著強(qiáng)于免疫后的野生型小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ。因此,利用HLA-A11/DR1小鼠鑒定得到了EBOV-NP蛋白中的5個(gè)新型HLA-A11限制性CTL表位,而QR-9由于在轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠均能產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng),因此該表位肽并非HLA-A11特異性的。本研究成功制備新型HLA-A2/DR15雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型,并證明其具有正常體液免疫反應(yīng)及HLA-DR15限制性細(xì)胞免疫反應(yīng)功能,該模型為抗原表位的篩選鑒定及新型疫苗、藥物的研究提供了一種新技術(shù)手段。同時(shí),利用HLA-A11/DR1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型進(jìn)行了EBOV-NP蛋白HLA-A11限制性CTL表位的篩選鑒定,獲得5個(gè)EBOV-NP蛋白HLA-A11限制性表位,為埃博拉病毒表位篩選鑒定及新型疫苗研究提供了新的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R373
【圖文】：

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文1. 材料與方法1.1 材料1.1.1 HLA-DRB15 基因的合成與克隆參 照 GenBank 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 獲 取 的 HLA-DRB1*15:01 基 因 核 苷 酸 序 列（GenBank:HM067861.1），利用生物信息學(xué)綜合分析基因密碼子組成，GC 含量、正向重復(fù)序列和反向重復(fù)序列等進(jìn)行核苷酸序列優(yōu)化后的 HLA-DRB15 基因，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的基因長(zhǎng)度為 3136bp，如圖 1.1 所示，其中包括的小鼠 H-2-IAβ的啟動(dòng)子序列、5`非編碼區(qū)、優(yōu)化后的 HLA-DRB1*15:01序列以及 3`非編碼區(qū)，并分別在序列的上游和下游添加酶切位點(diǎn) Hind III，克隆到pET-32a 載體上。

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文.實(shí)驗(yàn)結(jié)果制備 HLA-A2/DR15 雙轉(zhuǎn)基小鼠模型的策略是同時(shí)將外源 HLA-A2 分子與LA-DR15 分子整合到野生型小鼠基因組，同時(shí)沉默 H-2-β2m 分子和 H-2-Iaβ分子功能，這樣得到的轉(zhuǎn)基因小鼠同時(shí)具有 HLA-A2 限制性和 HLA-DR15 限制性。驗(yàn)室前期已經(jīng)獲得 HLA-A2/DR1（HLA-A2+/+/DR1+/+H-2-β2m-/-/IAβ-/-）雙轉(zhuǎn)基因鼠，由于 HLA-DR 分子具有相同的α鏈，該轉(zhuǎn)基因小鼠可提供 HLA-A2 分子的同也可提供 HLA-DRA 基因。因此，本研究首先構(gòu)建 HLA-DRB15 轉(zhuǎn)基因小鼠，其與 HLA-A2/DR1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交，獲得 HLA-A2/DR15 雙轉(zhuǎn)基因小鼠型。制備示意圖如圖 1.2 所示。

圖 1.3 pET-32a-DRB15 酶切鑒定B15質(zhì)粒； 2：pET-32a-DRB15酶切結(jié)3：Trans 15K DNA Marker 1.4 pET-32a-DRB15 重組質(zhì)粒 PCR 鑒 pET-32a-DRB15； 2：5×10-2ng pET-32

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫繼麗;杜可明;傅敏;孫瑛;金曄;謝軍華;季蕓;楊健豪;稽月華;張錚;毛臻;劉達(dá)莊;錢(qián)開(kāi)誠(chéng);;20596名漢族造血干細(xì)胞供者HLA多態(tài)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[J];中國(guó)輸血雜志;2006年05期

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1 曾揚(yáng);人MHC轉(zhuǎn)基因小鼠模型建立及其應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2016年

本文編號(hào)：2803965