本文關鍵詞：MCU介導線粒體分裂蛋白Drp-1在人中性粒細胞遷移中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景嗜中性粒細胞(Polymorphonuclear nertrophils, PMNs)占白細胞總量的80%以上,在血液的非特異性細胞免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用,它處于機體抵御病原微生物、特別是在化膿性細菌入侵的第一線。成熟的中性粒細胞從骨髓中釋放出來,以靜息狀態(tài)在外周血中循環(huán),當炎癥發(fā)生時,它們被趨化性物質(zhì)刺激后,迅速啟動細胞內(nèi)一系列復雜的信號級聯(lián)反應,胞內(nèi)蛋白和細胞骨架重新分布,幾分鐘后,細胞呈現(xiàn)出頭部寬大而尾部狹長的極性化狀態(tài),然后快速的穿越血管內(nèi)皮定向移動到感染部位,發(fā)揮殺菌致炎癥的作用。由于中性粒細胞內(nèi)含有大量溶酶體酶,因此能將吞噬入細胞內(nèi)的細菌和組織碎片在吞噬包內(nèi)分解。臨床上的一些疾病如慢性阻塞性肺疾病、哮喘、類風濕性關節(jié)炎、敗血癥、動脈粥樣硬化、缺血/再灌注損傷、病毒性心肌炎、過敏反應、炎癥性皮膚病甚至腫瘤的發(fā)生和轉移都和中性粒細胞遷移功能有關。因此深入探討中性粒細胞極性化過程中的信號機制,對尋找新的治療和干預靶點,防止中性粒細胞異常激活導致的組織損傷具有重要意義。中性粒細胞受到炎癥釋放的介質(zhì)等化學因子的作用后,可以朝該化學因子濃度高的方向移動,這種現(xiàn)象稱為趨化作用(chemotaxis),該化學物質(zhì)稱為趨化因子(chemotactic factor)。中性粒細胞的趨化因子有兩類：一類是自身組織損傷釋放的因子,例如膠原和纖維蛋白片段、白細胞介素8(intermediate chemoattractants, IL-8)及補體活化產(chǎn)物等；另一類是微生物來源的含有N-早酰蛋氨酸殘基的多肽,例如甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine,fMLP)。fMLP和IL-8代表兩類不同作用類型的趨化因子,fMLP刺激作用最強,它先與G蛋白偶聯(lián)甲酰肽受體(formyl peptide receptor 1, FPR-1)和類甲酰肽受體(formyl peptide receptor like-1, FPRL-1)結合通過不依賴PI3K的P38 MAPK途徑激活中性粒細胞.而IL-8則與G蛋白偶聯(lián)受體家族CXCR1和CXCR2結合通過以PI3K依賴的信號通路來完成的。所以本研究采用了fMLP和IL-8這兩種趨化因子來作為刺激中性粒細胞的趨化劑進行實驗。細胞內(nèi)游離Ca2+濃度(cytosolic free Ca2+ concentration)升高被認為參與中性粒細胞應對外界刺激物的各種生理病理反應,包括趨化和遷移、活性氧的產(chǎn)生等。中性粒細胞趨化劑作用于人中性粒細胞胞膜上的G-蛋白偶聯(lián)受體,激活磷脂酶C水解成1,4,5-肌醇三磷酸(D3)和二酰甘油(DAG),IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結合,從而誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放Ca2+,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+清空可以激活細胞膜上的鈣庫耗竭調(diào)節(jié)鈣內(nèi)流通道(store-operated calcium entry. SOCE),使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高。DAG可以激活受體調(diào)節(jié)鈣內(nèi)流通道(receptor-operated calcium entry, ROCE),也使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體都是鈣庫,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可以儲存約500μM Ca2+,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+排空將使細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度從0.1μM上升到1μM,若進一步上升則大大增加全細胞鈣離子毒性,此時線粒體Ca2+緩沖系統(tǒng)有效地防止全胞內(nèi)Ca2+異常升高。意大利的Rizzuto發(fā)現(xiàn)線粒體可以儲存100-300pM的Ca2+。從IP3通道流出來的Ca2+能夠通過線粒體外膜的VDAC通道,接著流入線粒體內(nèi)膜上的一個鈣單向轉運體(mitochondrial calcium uniporter, MCU)。50年多前,人們就開始知道線粒體是通過位于線粒體內(nèi)膜上的低親和力、高選擇性的離子通道線粒體鈣單向轉運體MCU,跨內(nèi)膜膜電位(△Ψm)(內(nèi)負)是使Ca2+在線粒體基質(zhì)蓄積的驅(qū)動力,線粒體通過鈣單向轉運體MCU攝取Ca2+是依靠內(nèi)負的膜電位而不是共轉運其他離子也不與ATP偶聯(lián),MCU的分子組成一直無法確定。直到2011年哈佛大學醫(yī)學院和馬薩諸塞綜合醫(yī)院研究人員通過查閱人類基因組項目數(shù)據(jù)庫資料并結合實驗分析,終于發(fā)現(xiàn)了驅(qū)動線粒體鈣通道機制的關鍵蛋白CCDC109A,即MCU。 MCU定位于線粒體內(nèi)膜,由MICU1、 MICUR1(調(diào)節(jié)伴侶)和MCU(成孔亞基)組成。盡管MCU與Ca2+親和力低,但當細胞受到刺激時,線粒體的基質(zhì)Ca2+濃度能迅速改變,這是因為線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或質(zhì)膜上的Ca2+通道相鄰,線粒體低親和力的攝鈣系統(tǒng)暴露于高Ca2+濃度的微域,從而有利于線粒體的攝入。迄今的文獻已經(jīng)表明MCU參與的線粒體內(nèi)Ca2+內(nèi)穩(wěn)態(tài)介導多種細胞反應,一方面在維持細胞內(nèi)Ca2+信號和震蕩起著緩沖作用,另一方面可以對線粒體本身的物質(zhì)和能量代謝、細胞分裂和分化、細胞生存和死亡等均具有重要的調(diào)節(jié)功能。線粒體是一種處于高度運動狀態(tài)的細胞器,頻繁地出現(xiàn)分裂和融合,線粒體分裂、融合和沿微管定向移動的過程被稱為線粒體動力學。隨著分裂和融合蛋白突變引起的眾多凋亡和自噬的發(fā)現(xiàn),線粒體分裂和融合被認為是細胞生存的基石,對健康和疾病有重要的影響。線粒體動力學包括線粒體在細胞中融合與分裂,其形態(tài)分布不斷地變化,形成動態(tài)平衡,以對不同生理功能和不同區(qū)域細胞能量的需要進行“整合性應答”,在維持包括細胞極性、應激反應和凋亡自噬等細胞穩(wěn)態(tài)的過程中起著重要的作用。線粒體動力學是裂解和融合動態(tài)平衡的過程。調(diào)節(jié)裂解的主要蛋白有動態(tài)相關蛋白1(dynamin-related protein-1,Drp-1)和接頭蛋白1 (fission protein-1, Fis-1), Drp-1是一種進化上保守的GGTP酶,受翻譯后磷酸化ser-616修飾而激活,通過接頭蛋白Fis-1定位并募集于線粒體膜進而調(diào)節(jié)線粒體的分裂,募集的位置通常位于線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸的位置,該位置富含Drp-1的受體Mff,這被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標記的線粒體分裂位點(ER-associated mitochondrial division, ERMD),研究發(fā)現(xiàn)成蛋白INF2和myosin Ⅱ等細胞骨架蛋白在ERMD的形成過程中也起著重要的作用；調(diào)節(jié)線粒體分裂的Drp-1�？梢�,線粒體形態(tài)動力學的變化參與著細胞內(nèi)信息傳遞和能量代謝,并與細胞的生理病理改變密切相關。其中在介導線粒體分離方面最重要的蛋白是Drp-1, Drp-1是一種受到Ca2+信號或Ca2+依賴蛋白調(diào)節(jié)的蘇氨酸/絲氨酸激酶,在結構上289-319節(jié)段包含典型的CaM調(diào)節(jié)區(qū)域,其磷酸化受到胞外Ca2+信號的調(diào)節(jié)。這種Ca2+信號與細胞不同區(qū)域Ca2+信號有關,另一方面,Drp-1在Ser-637的磷酸化則可以抑制GTP酶的活性和線粒體的分裂。在線粒體融合方面,線粒體融合蛋白(mitofusin, Mfn)調(diào)節(jié)線粒體外膜融合,Opal (optic atrophy-1, Opal)蛋白調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜融合,Mfn蛋白包括Mfnl和Mfn2兩個亞型,定位于線粒體外膜上,其N端結構域(GTP酶結構域)和C端結構域均朝向細胞漿；Mfnl和Mfn2相互作用調(diào)節(jié)不同線粒體外膜的融合。Opal定位于線粒體內(nèi)膜,主要參與線粒體嵴的重構和內(nèi)膜的融合。內(nèi)膜和外膜各自獨立地融合,但最近研究表明,Opal的促融合作用有賴于Mfnl的參與。目前對涉及線粒體動力學的信號通路的研究主要包括Ca2+信號通路、Notch、 NF-κB、Wnt等信號通路,這些信號通路或參與線粒體動力學的調(diào)節(jié),或與線粒體動力學一起參與細胞生老病死等狀態(tài)的調(diào)節(jié)。線粒體作為細胞生物氧化和能量轉換的主要場所,為機體提供90%以上的能量,而且線粒體中也存在類似中性粒細胞趨化物fMLP的甲�；�,經(jīng)推測線粒體動力學或鈣信號在中性粒細胞遷移中有作用,但沒有相關研究。目的本研究通過均一、低濃度fMLP口IL-8刺激人中性粒細胞建立極性和趨化模型,首先進行慢性阻塞性肺疾病病人中性粒細胞極性化實驗和western-blotting檢測,初步研究MCU通道蛋白與中性粒細胞極性化的關系,采用MCU通道蛋白抑制劑Ru360、激動劑spermine和線粒體分裂蛋白Drp-1抑制劑Mdivi-1預處理中性粒細胞,通過Zigmond Chamber、Transwell、免疫印跡技術、confocal、 western-blotting觀察細胞形態(tài)、骨架蛋白分子聚合F-actin、線粒體分布情況、細胞質(zhì)內(nèi)和線粒體內(nèi)鈣離子變化情況和線粒體分裂蛋白的表達情況,探討MCU通道蛋白介導線粒體分離在中性粒細胞遷移中的作用。方法1.采用經(jīng)典的梯度密度離心的方法分離中性粒細胞,主要包括紅細胞沉降,淋巴細胞分離液密度梯度離心和低滲裂解殘存的紅細胞三個步驟。獲得的中性粒細胞進行臺盼藍染色和瑞氏-吉姆薩染色,分析細胞活性和純度,細胞的活度和純度分別大于98%和95%。2.不同濃度的Ru360或spermine于37℃預處理中性粒細胞30分鐘,用Zigmond Chamber建立fMLP或IL8的線性濃度梯度,觀察中性粒細胞的極性改變。3.不同濃度的Ru360或spermine于37℃預處理中性粒細胞30分鐘,采用Transwell小室實驗檢測中性粒細胞的遷移能力的變化。4.采用細胞免疫熒光方法在激光共聚焦顯微鏡上檢測聚合F-actin和線粒體在胞內(nèi)的分布。5.使用鈣離子敏感性指示劑fluo4/AM和rhod2預處理中性粒細胞在激光共聚焦顯微鏡下監(jiān)測細胞內(nèi)和線粒體內(nèi)鈣離子濃度的變化。6.采用Western-blotting檢測MCU、Drp-1、磷酸化Drp-1(616)和磷酸化-Drp-1(637)的蛋白含量改變情況。7.實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±SD)表示,數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件處理分析。三組及三組以上樣本均數(shù)比較滿足方差齊性用One-way ANOVA方差分析,組間兩兩比較采用LSD法；若方差不齊,采用welch檢驗,組間兩兩比較采用Dunnett's T3法。p0.05為存在顯著性差異。結果1.慢性阻塞性肺疾病病人的中性粒細胞極性化率明顯減低(p0.01), MCU通道蛋白表達明顯減少(p0.01)。2.MCU通道蛋白抑制劑Ru360預處理的中性粒細胞從10μM的劑量組開始出現(xiàn)極性化數(shù)量明顯減少(p0.01), MCU通道蛋白激動劑spermine預處理的中性粒細胞從20μM的劑量組開始出現(xiàn)極性化數(shù)量明顯增多(p0.01)。Ru360預處理中性粒細胞從10μM的劑量組開始出現(xiàn)遷移數(shù)量明顯減少(p0.01)。spermine預處理的中性粒細胞從10μM的劑量組開始出現(xiàn)遷移數(shù)量明顯增多(p0.05)。3.10μMRu360抑制IL-8誘導的中性粒細胞的極性化和趨化(p0.01),20μMspermine促進IL-8誘導的中性粒細胞的極性化和趨化(p0.01)。4.聚合的F-actin在熒光下顯示為紅色,靜息狀態(tài)下的中性粒細胞中質(zhì)膜下紅色熒光呈現(xiàn)對稱分布,fMLP刺激后的中性粒細胞出現(xiàn)明顯的不對稱紅色熒光,細胞頭部熒光增強且數(shù)量多,尾部也有熒光聚集。10μM Ru350處理組又恢復對稱分布,20pM spermine處理組熒光不對稱分布更明顯。5.10μM Ru360和20μM spermine預處理的MCU通道蛋白表達未見明顯差異(p0.05),對胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+影響也不大(p0.05),參與中性粒細胞極性化和趨化的關鍵蛋白μ-calpain活性也未見明顯差異(p0.05)。6.10μMRu360抑制中性粒細胞線粒體的Ca2+攝取(P0.01),而20μM spermine促進線粒體的Ca2+攝取(p0.01)。7.中性粒細胞在靜息狀態(tài)下,線粒體呈現(xiàn)分枝樣的管狀網(wǎng)絡結構,分布在細胞中間,而fMLP刺激后線粒體出現(xiàn)散點狀,主要位于尾部,10μMRu360預處理后線粒體又呈現(xiàn)分枝樣的管狀網(wǎng)絡結構,分布在細胞中間。20pM spermine預處理后線粒體呈現(xiàn)散點狀更明顯,主要位于尾部。8.10μMRu360預處理中性粒細胞的P-Drp1(Ser616)蛋白表達減弱(p0.05),20μM spermine預處理P-Drp1(Ser616)蛋白表達增強(p0.05)。9.線粒體分裂蛋白Drp-1抑制劑Mdivi-1從5μM開始出現(xiàn)中性粒細胞極性化和遷移細胞數(shù)量降低(p0.05)抑制中性粒細胞的極性化和趨化。結論1.MCU通道蛋白在中性粒細胞極性化和趨化過程中起著重要的作用。2.MCU通道蛋白對中性粒細胞極性化和趨化的影響是通過影響線粒分裂蛋白Drp-1來實現(xiàn)的。
【關鍵詞】：MCU 中性粒細胞 極性化 趨化
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 前言19-25
• 材料和方法25-38
• 1. 材料25-30
• 1.1 中性粒細胞25
• 1.2 主要試劑25-26
• 1.3 主要溶液的配制26-30
• 1.4 實驗儀器30
• 2. 實驗方法30-37
• 2.1 中性粒細胞分離30-31
• 2.2 中性粒細胞純度和活力測定實驗31-32
• 2.3 中性粒細胞的藥物預處理和刺激32
• 2.4 中性粒細胞細胞極性化實驗32-33
• 2.5 中性粒細胞趨化實驗33-34
• 2.6 中性粒細胞聚合F-actin的免疫熒光測定34
• 2.7 細胞質(zhì)內(nèi)游離Ca~(2+)濃度檢測34-35
• 2.8 線粒體內(nèi)游離Ca~(2+)濃度檢測35
• 2.9 μ-calpain活性測定35
• 2.10 中性粒細胞線粒體分布熒光測定35-36
• 2.11 免疫印跡36-37
• 3. 數(shù)據(jù)處理37-38
• 結果38-53
• 1. 慢性阻塞性肺疾病病人對fMLP誘導的中性粒細胞極性化能力降低38
• 2. 慢性阻塞性肺疾病病人中性粒細胞的MCU通道蛋白含量減少38-39
• 3. MCU通道在人中性粒細胞極性化和趨化中的作用39-45
• 4. Ru360和spermine預處理對fMLP誘導人中性粒細胞的F-actin的聚合的影響45-46
• 5. Ru360和spermine預處理對中性粒細胞胞質(zhì)內(nèi)Ca~(2+)濃度及μ-calpain活性的影響46-48
• 6. Ru360和spermine預處理對中性粒細胞線粒體內(nèi)Ca~(2+)攝取的影響48
• 7. Ru360和spermine預處理對中性粒細胞的線粒體形態(tài)和分布的影響48-49
• 8. Ru360和spermine預處理對中性粒細胞線粒體分裂蛋白的影響49-50
• 9. 線粒體分裂蛋白Drp-1抑制劑Mdivi-1預處理對中性粒細胞極性化和趨化的影響50-53
• 討論53-58
• 全文小結58-59
• 參考文獻59-63
• 英文縮略詞表63-64
• 碩士期間發(fā)表論文64-65
• 致謝65-66

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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2 駱靜;方麗;袁琦;蔡婷;楊俊偉;;線粒體功能障礙在糖尿病腎病進展的作用[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2015年20期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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  本文關鍵詞：MCU介導線粒體分裂蛋白Drp-1在人中性粒細胞遷移中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：280302