【摘要】：蚊蟲(chóng)傳播許多疾病,包括瘧疾、登革熱、西尼羅河熱、日本腦炎、絲蟲(chóng)病等,是媒介傳染病中重點(diǎn)防控的媒介昆蟲(chóng)�；瘜W(xué)防制因具有簡(jiǎn)單快捷、方便高效等優(yōu)點(diǎn),自20世紀(jì)50年代以來(lái),一直是媒介傳染病防治的主要策略,然而隨著化學(xué)殺蟲(chóng)劑的大范圍、連續(xù)、不規(guī)范使用,蚊蟲(chóng)面對(duì)自然和人為選擇壓的作用,抗藥性逐漸產(chǎn)生,并不斷發(fā)展,目前,蚊蟲(chóng)抗藥性的發(fā)展速度已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)人們對(duì)它的抗藥性控制步伐,加重了全世界媒介防治工作的負(fù)擔(dān),也使得全球公共衛(wèi)生問(wèn)題成為繼全球變暖之后,需要各國(guó)加強(qiáng)合作,投入更多的人力和資金來(lái)面對(duì)的重要難題。蚊蟲(chóng)抗藥性的分子機(jī)制主要體現(xiàn)在:代謝抗性、靶標(biāo)抗性(kdr抗性)、表皮抗性和行為抗性。但蚊蟲(chóng)抗藥性產(chǎn)生的本質(zhì)是由基因突變?cè)斐傻?包括基因拷貝數(shù)目的差異,基因表達(dá)量水平的改變以及基因結(jié)構(gòu)的變異。目前,代謝抗性和靶標(biāo)抗性已被廣泛研究,而表皮抗性和行為抗性的研究則相對(duì)較少。蚊蟲(chóng)的表皮覆蓋著其整個(gè)身體表面,在其發(fā)育過(guò)程中起著保護(hù)形體,防御外來(lái)不利因素的作用,毫無(wú)疑問(wèn),表皮極大地增強(qiáng)了蚊蟲(chóng)的生存和適應(yīng)能力,以確保蚊蟲(chóng)發(fā)展為昆蟲(chóng)界最為成功的類群之一。表皮在殺蟲(chóng)劑抗性中發(fā)揮著減少滲透率和隔離殺蟲(chóng)劑的作用。本實(shí)驗(yàn)室選取淡色庫(kù)蚊各生理發(fā)育階段的蟲(chóng)體,分別是:I、II、III、IV齡幼蟲(chóng)、蛹和羽化3天后的未吸血的雌蚊,提取完整mRNA后,運(yùn)用新一代高通量測(cè)序技術(shù),以Illumina Hiseq為平臺(tái),在全基因組范圍內(nèi)鑒定與抗藥性有關(guān)敏感品系與抗性品系中差異表達(dá)的基因,并從中篩選出與表皮相關(guān)的蛋白基因,篩選標(biāo)準(zhǔn)是log2 Fold change3.0且Padj0.05,稱為顯著差異表達(dá)基因,并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行實(shí)時(shí)表達(dá)量的驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下:1.使用Illumina Hiseq平臺(tái)對(duì)敏感品系和抗性品系2組樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè),每組樣品3個(gè)重復(fù),共計(jì)6個(gè)樣品,每個(gè)樣品的平均產(chǎn)出數(shù)據(jù)是6.66Gb,原始數(shù)據(jù)過(guò)濾后,將得到的Clean reads與致倦庫(kù)蚊的基因組比對(duì)進(jìn)行二次整合,得到新轉(zhuǎn)錄本13,517個(gè),其中4,199個(gè)屬于lncRNA,屬有蛋白編碼基因的新的可變剪接亞型的有8,653個(gè),未知蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本有665個(gè)。2.差異表達(dá)基因:敏感品系與抗性品系對(duì)比的3組重復(fù)樣本中,表達(dá)上調(diào)基因分別有1035個(gè),944個(gè)和657個(gè)基因,而表達(dá)下調(diào)基因分別有2680個(gè),1215個(gè)和975個(gè)基因,3組樣本組間比較后,共有167個(gè)表達(dá)上調(diào)基因,145個(gè)表達(dá)下調(diào)基因。3.Gene Ontoloty(GO)功能分析:GO功能分析分為分子功能、細(xì)胞組分和生物過(guò)程三大功能類,分子功能層面共有224個(gè)基因參與,細(xì)胞組分層面共有149個(gè)基因參與,生物過(guò)程則有272個(gè)基因參與。4.目的基因驗(yàn)證:對(duì)組間差異比較后的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,篩選出3個(gè)目的基因,實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證后,抗性品系中XM_001845883.1的表達(dá)高于敏感品系,提示該表皮蛋白基因參與蚊蟲(chóng)抗藥性的形成。本研究報(bào)告了淡色庫(kù)蚊氯氰菊酯抗性品系與敏感品系的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果,同時(shí)挑選并驗(yàn)證了3個(gè)表皮蛋白目的基因與蚊蟲(chóng)抗藥性的關(guān)系。該研究不僅為進(jìn)一步解釋蚊蟲(chóng)表皮抗性的形成原因提供適當(dāng)?shù)目茖W(xué)依據(jù),而且為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)以表皮蛋白為靶標(biāo)的新型殺蟲(chóng)劑提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R384.1
【圖文】：

整性檢測(cè)：用 DEPC 水在通風(fēng)條件下浸泡電泳槽 2 小時(shí)，后用酒精 1ulRNA 和 9ul lodding buffer 混勻，150v 電壓，時(shí)間為 30min 膠電泳，進(jìn)行條帶比對(duì)鑒定 RNA 完整性。 淡色庫(kù)蚊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究流程取本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的淡色庫(kù)蚊氯氰菊酯抗性品系和敏感品系，提取使用 DNase I（RNase free）去除殘余的 DNA，使用 NanoDrop 核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定 RNA 濃度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取的 RN后構(gòu)建 cDNA 第一、二鏈反應(yīng)體系,合成 cDNA 第二鏈后，將雙平，加接 EcoRⅠadaptor 接頭，末端的磷酸化及 XhoⅠ酶切后，使回收 dscDNA。隨后使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 和 ABI Stepme PCR System 進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，質(zhì)量合格后方可使用 Illumina HiSNA-seq。具體操作流程如下圖：

測(cè)序的原始數(shù)據(jù) raw reads 是指質(zhì)量較低、接頭出現(xiàn)污染以及未知堿基 N>5%的 reads，數(shù)據(jù)分析前需去除這些 raw reads,以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。我們使用內(nèi)部軟件進(jìn)行過(guò)濾，具體步驟如下：1) 去除包含接頭的 reads(存在接頭污染)；2) 去除未知堿基 N 含量大于 5%的 reads；3) 去除低質(zhì)量的 reads (我們定義：質(zhì)量值低于 10 的堿基與該 reads 總堿基數(shù)之比大于 20% 的 reads 為低質(zhì)量的 reads)。過(guò)濾后得到的高質(zhì)量 reads 我們稱為 "Clean Reads" ，并以 FASTQ［31］格式保存。（2） 參考基因組的比對(duì)我們使用 HISAT［32］軟件（版本：v0.1.6-beta；參數(shù)：phred64；sensitive；no；discordant；no mixed；I 1；X 1000）將 clean reads 比對(duì)到參考基因組—致倦庫(kù)蚊的基因組上。

濟(jì)南大學(xué)碩士學(xué)位論文只有其中之一被連接；⑤可變的外顯子 5’剪接位點(diǎn)；⑥可變的外顯子 3’剪接位點(diǎn)；⑦內(nèi)含子滯留（intron retain），外顯子連接時(shí)連同內(nèi)含子一起連接，真核生物體內(nèi)此方式發(fā)生率最低，約占 5%。為檢測(cè)不同樣品之間的差異剪接基因( DSGs )，我們使用 rMATS［36］軟件。rMATS 是一款用于 RNA-seq 后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行 DSGs 檢測(cè)的軟件，可計(jì)算樣品測(cè)序后出現(xiàn)的 inclusion 亞型和 skipping 亞型的相對(duì)豐度，如圖 3 所示，同時(shí)計(jì)算相應(yīng)的 P、FDR 值來(lái)衡量樣品間剪接差異的顯著性，這里我們使用 FDR <= 0.05 作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，將小于該閾值的 DSGs 定義為顯著差異的 DSGs。

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本文編號(hào)：2801852