【摘要】：流行性感冒是由流感病毒引起的傳染病,其特點(diǎn)是流行突然、迅速蔓延、波及面廣且具有一定的季節(jié)性,也被成為季節(jié)性流感。流感病毒分為A、B、C三型,甲型和乙型流行范圍最廣,其中甲型流感病毒(IAV)分類根據(jù)其包膜糖蛋白紅細(xì)胞凝集素(H1~H18)與神經(jīng)氨酸酶(N1~N11)的差異。WHO報(bào)告顯示每年流感會(huì)感染世界5-10%人口,發(fā)病人口在300-500萬人,導(dǎo)致二十萬人至五十萬人死亡。H3亞型流感病毒是造成季節(jié)性流感的主要亞型之一,存在著成為大流行毒株或?yàn)榇罅餍卸局晏峁┗虻目赡苄?是流感防治的重點(diǎn)。其中預(yù)防流感的最有效的措施是接種流感疫苗。流感病毒HA蛋白具有HA1球狀頭部區(qū)結(jié)構(gòu)域與HA2頸部區(qū)結(jié)構(gòu)域,其中HA1頭部球狀區(qū)可以與宿主表面受體唾液酸受體結(jié)合,HA2頸部區(qū)可以在低pH(5-6)條件作用下,發(fā)生構(gòu)象變化,拉近與細(xì)胞膜距離,促使細(xì)胞膜與病毒之間膜融合。HA蛋白作為流感病毒功能蛋白成為研究的熱點(diǎn)。HA蛋白HA1頭部區(qū)的氨基酸序列高頻突變性以及糖基化修飾的保護(hù)作用是疫苗設(shè)計(jì)的難點(diǎn)。其HA2頸部區(qū)結(jié)構(gòu)相對(duì)保守,但是由于暴露時(shí)間短,免疫原性差,無法誘導(dǎo)較強(qiáng)免疫反應(yīng),也是疫苗設(shè)計(jì)的難點(diǎn)之一。構(gòu)建具有HA三聚體結(jié)構(gòu)的重組蛋白,模擬流感病毒感染時(shí)的天然構(gòu)像一直是研究的熱點(diǎn)。同時(shí)隨著針對(duì)HA2廣譜中和抗體的發(fā)現(xiàn),利用HA2全長或HA2保守區(qū)表位作為免疫原誘導(dǎo)廣譜中和抗體的方式得了關(guān)注�；诖吮緦�(shí)驗(yàn)組通過保守序列分析得到了一段保守的HA2表位:DLWSYNAELLVALENQ。由于該表位分子量小,將其連接于諾如病毒P顆粒免疫小鼠,得到了具有中和活性的抗體,該免疫原可以誘導(dǎo)針對(duì)HA2頸部區(qū)抗體,阻止HA2結(jié)構(gòu)變化,抑制膜融合。由于諾如病毒在人體中可能存在預(yù)存免疫,同時(shí)為了進(jìn)一步驗(yàn)證該表位可靠性,本課選擇新的載體連接HA2表位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。研究表明Ferritin蛋白可以自組裝形成直徑為12nm的24聚體,其N段可以插入外源基因,在插入HA蛋白后可以使蛋白形成三聚體構(gòu)象。但是Ferriitn對(duì)于多肽的遞呈能力尚不清楚�；谏鲜龇治�,我們期望獲得保守的HA,HA2,HA2(90-105)蛋白序列連接Ferritin載體,形成有三聚體構(gòu)象的免疫原。同時(shí)驗(yàn)證HA2(90-105)表位的可靠性以及Ferritin載體對(duì)短肽的遞呈能力。我們分析了1920-2017年的H3亞型的HA蛋白序列,得到了保守的HA全長,HA2全長序列。將三段序列用SSG linker分別連接Ferritin蛋白,便于形成三聚體構(gòu)象以及暴露表位與Ferritin外。為研究糖基化對(duì)HA蛋白的影響,我們采用哺乳細(xì)胞與E.coil兩種表達(dá)體系進(jìn)行表達(dá)。其中HA全長(762aa),HA2全長(412aa),在兩種表達(dá)體系中,均無蛋白表達(dá),通過序列分析認(rèn)為可能表達(dá)體系選用錯(cuò)誤。HA2(90-105)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系中有少量表達(dá),在E.coli表達(dá)體系中可以大量表達(dá),經(jīng)過蛋白純化,粒徑分析,電鏡觀察進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,得到具有12nm直徑的球形結(jié)構(gòu)免疫原進(jìn)行免疫,期望可以獲得針對(duì)流感病毒HA2保守序列的具有廣譜中和活性抗體。我們使用弗氏佐劑與氫氧化鋁佐劑免疫,以不同劑量的重組蛋白,免疫BALB/c雌鼠,間隔兩周,免疫四次。以PBS,Ferritin蛋白作為陰性對(duì)照,H3N2病毒作為陽性對(duì)照。檢測免后血清與HA2表位特異性抗體水平,弗氏佐劑免疫組針對(duì)表位特異性抗體效價(jià)約為10~4,不同劑量產(chǎn)生抗體效價(jià)相似,說明重組蛋白具有一定免疫原性且與劑量無關(guān)。鋁佐劑組效價(jià)隨劑量升高而減少,且低于弗氏佐劑組,病毒對(duì)照組未產(chǎn)生特異性抗體。免后血清對(duì)H3N2 HA蛋白具有一定的結(jié)合能力,弗氏佐劑組高于鋁佐劑組。弗氏佐劑組免后血清與H3N2病毒抗體效價(jià)約為10~5,鋁佐劑效價(jià)低于弗氏佐劑組。四次免疫后,使用H3N2病毒進(jìn)行加強(qiáng)免疫,弗氏佐劑組HA2表位特異性抗體水平明顯升高,抗體效價(jià)升高約為10~3倍。鋁佐劑組抗體水平雖有升高,但是低于弗氏佐劑組。結(jié)果說明,弗氏佐劑可以更好的增強(qiáng)重組蛋白免疫原性。由于HA2(90-105)表位處于HA2頸部結(jié)構(gòu)域,所誘導(dǎo)抗體無法結(jié)合HA1頭部區(qū),所以免疫血清理論上不會(huì)出現(xiàn)血凝抑制現(xiàn)象,實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致�？贵w分型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),免疫血清IgG1,IgG2a,IgG2b均有顯著提升,說明重組蛋白主要誘導(dǎo)是體液免疫,但是IgM水平?jīng)]有明顯升高,體液免疫水平并不理想。體外微中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,弗氏佐劑組免疫后血清與相比,免疫前血清對(duì)H3亞型中和活力明顯提高,弗氏佐劑100μg組ID 50為863.7,比免前血清ID50高6.16倍,具有較好的中和活性。氫氧化鋁佐劑100μg組比免前血清ID50僅高1.21倍。結(jié)果顯示,弗氏佐劑免疫小鼠可以獲得具有中和能力的血清,氫氧化鋁佐劑不能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體。結(jié)合Elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果,氫氧化鋁佐劑無法有效地增強(qiáng)重組蛋白免疫原性,導(dǎo)致血清中和活力中和較弱。小鼠免疫重組蛋白后,采用H3N2病毒進(jìn)行攻毒。每24h測量小鼠體重。PBS組體重下降38%,Ferritin組下降33%,弗氏佐劑組體重下降不足5%,鋁佐劑組體重約10%-20%。說明免疫重組蛋白對(duì)小鼠具有一定保護(hù)能力。綜上,以Ferritin為載體的HA2(90-015)表位重組免疫原對(duì)H3N2具有一定的中和能力。HA2(90-105)表位是潛在的廣譜中和疫苗候選表位。Ferritin對(duì)于HA2(90-105)的遞呈較弱,其遞呈表位抗原的能力還有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

圖 1.2 2016-1017 年中國流感病毒流行情況（數(shù)據(jù)來源：中國國家流感中心）圖1.3 The putative evolutionary history of the eight genes of the new A(H1N1)virus.[12]2

圖 1.6 甲型流感結(jié)構(gòu)圖[25].4 流感病毒感染機(jī)制在流感病毒入侵宿主細(xì)胞時(shí)，被活化的 HA 蛋白通過結(jié)合宿主細(xì)胞膜表白以及糖脂唾液酸受體的末端[26]。結(jié)合之后，病毒顆粒通過胞吞進(jìn)入細(xì) pH 的胞吞小泡誘導(dǎo) HA2 末端疏水的自由氨基酸殘基插入小泡膜中導(dǎo)致象變化，使病毒膜與細(xì)胞膜進(jìn)行融合，釋放病毒 RNA 到宿主細(xì)胞[27,28]。在病毒核衣殼進(jìn)入宿主細(xì)胞細(xì)胞核后，病毒開始進(jìn)入第一個(gè)復(fù)制周期期RNA聚合酶開始首先轉(zhuǎn)錄翻譯NP以及NS1蛋白，宿主細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)斷[19]。大量游離的 NP 導(dǎo)致，病毒內(nèi) mRNA 合成減少，同時(shí) cRNA 以及 v成增加。vRNA與游離的NP 結(jié)合，作為下個(gè)復(fù)制周期的模板[29]。后期主 HA，NA，M1 蛋白。HA 和 NA 蛋白經(jīng)宿主細(xì)胞修飾后，會(huì)被高爾基體細(xì)胞表面，成為包膜蛋白。NA蛋白會(huì)切割細(xì)胞膜上糖蛋白以及糖脂唾液

第三部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析第三部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1 流感表位的篩選我們分析了 10739 株 H3 亞型全長保守序列，以及 HA2 保守序列。獲得了一株保守的HA序列以及HA2序列。HA氨基酸序列與A/Kansas/04/2009（H3N2）一致，HA2 序列氨基酸序列與 A/Kansas/04/2009（H3N2）的 HA2 一致。HA2（90-105）序列來源于本實(shí)驗(yàn)組前期分析。該序列具有 T 細(xì)胞與 B 細(xì)胞表位。保守序列通過 weblogo 網(wǎng)站得出。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 Jean Huang;Rudruidee Karnchanasorn;Horng-Yih Ou;Wei Feng;Lee-Ming Chuang;Ken C Chiu;Raynald Samoa;;Association of insulin resistance with serum ferritin and aminotransferases-iron hypothesis[J];World Journal of Experimental Medicine;2015年04期

2 Satyanarayana Bejjani;Raghu Pullakhandam;Ravinder Punjal;K Madhavan Nair;;Gastric digestion of pea ferritin and modulation of its iron bioavailability by ascorbic and phytic acids in caco-2 cells[J];World Journal of Gastroenterology;2007年14期

3 ;Sequential changes of serum ferritin levels and their clinical significance in lamivudine-treated patients with chronic viral hepatitis B[J];World Journal of Gastroenterology;2004年07期

4 葉淑金,查良鎰,薛竹,李憶梅;THE DIAGNOSTIC VALUE OF DETERMINATION OF GASTRIC JUICE FERRITIN FOR GASTRIC CARCINOMA PATIENTS[J];Chinese Science Bulletin;1989年11期

5 劉書盈,劉樹芬,王華強(qiáng),武翠花,孫曉明;胸水多項(xiàng)指標(biāo)檢測診斷胸水性質(zhì)的臨床價(jià)值[J];山東醫(yī)藥;1989年04期

6 Sarah Hearnshaw;Nick Paul Thompson;Andrew McGill;;The epidemiology of hyperferritinaemia[J];World Journal of Gastroenterology;2006年36期

7 Yunxia Li;Qiang Guan;Yuhui Chen;Hongjie Han;Wuchao Liu;Zhiyu Nie;;Transferrin receptor and ferritin-H are developmentally regulated in oligodendrocyte lineage cells[J];Neural Regeneration Research;2013年01期

8 ;Molecular and functional characterization of ferritin in abalone Haliotis diversicolor supertexta[J];Acta Oceanologica Sinica;2012年03期

9 Luca Valenti;Paola Dongiovanni;Silvia Fargion;;Diagnostic and therapeutic implications of the association between ferritin level and severity of nonalcoholic fatty liver disease[J];World Journal of Gastroenterology;2012年29期

10 ;Low-temperature magnetic properties of horse spleen ferritin[J];Chinese Science Bulletin;2010年Z2期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 朱琳;何金彩;;The association between serum ferritin levels and post-stroke depression[A];華東六省一市第二十三次神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨2016年浙江省神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2016年

2 Lin Zhu;Jincai He;;High ferritin levels in stroke patients with depression[A];2015年浙江省神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2015年

3 Thomas H.MacRae;;The molecular chaperone activity of Artemin,a ferritin homology from Artemia Franciscana[A];湖南省生理科學(xué)會(huì)2006年度學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2007年

4 Lanxiang Tian;Changqian Cao;Yongxin Pan;;The influence of reaction temperature on biomineralization of ferrihydrite cores in human H-ferritin[A];中國科學(xué)院地質(zhì)與地球物理研究所2012年度（第12屆）學(xué)術(shù)論文匯編——地球深部結(jié)構(gòu)與過程研究室[C];2013年

5 張連兵;;Cellular Delivery with(Apo)ferritin as the Vehicle[A];2017年中國藥學(xué)大會(huì)暨第十七屆中國藥師周資料匯編[C];2017年

6 Changqian Cao;Xuxia Wang;Yao Cai;Lei Sun;Lanxiang Tian;Hao Wu;Xiaoqing He;Hao Lei;Weifeng Liu;Guanjun Chen;Rixiang Zhu;Yongxin Pan;;Targeted In Vivo Imaging of Microscopic Tumors with Ferritin-based Nanoprobes Across Biological Barriers[A];中國科學(xué)院地質(zhì)與地球物理研究所2014年度（第14屆）學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編——地球深部結(jié)構(gòu)與過程研究室[C];2015年

7 Elizabeth C. Theil;Takehiko Tosha;;Iron and Oxygen Chemistry in Nature's Nanocage Proteins,the Ferritins[A];中國化學(xué)會(huì)第26屆學(xué)術(shù)年會(huì)化學(xué)生物分會(huì)場論文集[C];2008年

8 何書豪;謝凱;曾柳根;盛軍慶;王軍花;洪一江;;池蝶蚌鐵蛋白ferritin基因的克隆、進(jìn)化分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測[A];中國南方十六�。ㄊ�、區(qū)）水產(chǎn)學(xué)會(huì)漁業(yè)學(xué)術(shù)論壇第二十六次學(xué)術(shù)交流大會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2010年

9 陳英;孟慶玲;喬軍;劉田莉;陳誠;貢莎莎;盧海亭;田路路;鐘文強(qiáng);孟丹;;細(xì)粒棘球蚴鐵蛋白(ferritin)基因的克隆及生物信息學(xué)分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì)第五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2016年

10 Kelong Fan;Minmin Liang;Xiyun Yan;;H-ferritin nanocaged doxorubicin nanoparticles specifically target and kill tumors with a single-dose injection[A];中國化學(xué)會(huì)第30屆學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集-第三十八分會(huì)：納米生物效應(yīng)與納米藥物化學(xué)[C];2016年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 代國知;解脲脲原體Ferritin蛋白和MsrA蛋白抗氧化功能及其機(jī)制研究[D];南華大學(xué);2015年

2 Sohail Ahmed Otho;家蠶Ferritin-1的重組表達(dá)及功能分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

3 石振華;過表達(dá)線粒體鐵蛋白在由6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森模型中的保護(hù)機(jī)制的研究[D];河北師范大學(xué);2008年

4 郝肇菁;Ferritin-L和SCCA1作為HBV共受體的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 鄶子昱;基于流感病毒H3亞型保守序列重組Ferritin免疫原性分析及保護(hù)活性的初步研究[D];吉林大學(xué);2018年

2 范海濤;基于Ferritin蛋白的甲型流感病毒M2e抗原納米顆粒的構(gòu)建及免疫學(xué)評(píng)價(jià)[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2018年

3 李曉麗;玉米籽粒特異表達(dá)大豆鐵蛋白Ferritin基因遺傳轉(zhuǎn)化研究[D];山西大學(xué);2012年

4 黃帥;非小細(xì)胞肺癌腦、骨轉(zhuǎn)移與腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性研究[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2010年

5 司海洋;重組Pyrococcus yayanosii CH1-ferritin 對(duì)缺鐵性貧血雌性SD大鼠補(bǔ)鐵效果的研究[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

6 丁聃;細(xì)粒棘球蚴鐵蛋白基因的重組表達(dá)、免疫學(xué)特性鑒定及免疫保護(hù)力研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2009年

7 李美玉;WSSV和干露脅迫條件下脊尾白蝦（Exopalamoncarin cauda）ferritin基因及熱休克蛋白70基因表達(dá)特征[D];上海海洋大學(xué);2012年

8 徐秀菊;盔形珊瑚屬HSP90、Ferritin、CuZnSOD基因的克隆與表達(dá)分析[D];廣東海洋大學(xué);2015年

9 王坤;丁苯酞對(duì)SOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因鼠脊髓Ferritin表達(dá)的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

10 王婭娜;細(xì)粒棘球蚴中國大陸株鐵蛋白基因的克隆、重組表達(dá)、純化及免疫學(xué)特性鑒定[D];寧夏醫(yī)學(xué)院;2006年

本文編號(hào)：2801526