【摘要】：研究目的應(yīng)用雜交瘤技術(shù),制備抗眼鏡蛇毒的單克隆抗體,為抗蛇血清的制備提供新的生產(chǎn)方法,解決抗蛇毒血清短缺問(wèn)題,為蛇傷救治提供幫助。研究方法一.免疫小鼠用定量的眼鏡蛇毒(Naja naja atra Venom NAV)溶液作為抗原,與佐劑完全混合并乳化后,通過(guò)皮下多點(diǎn)注射免疫balbc小鼠。二.細(xì)胞融合提取免疫小鼠血漿,采用間接ELISA法測(cè)定并篩選出效價(jià)高的免疫小鼠血漿。分離出該免疫小鼠的脾臟,獲得致敏B細(xì)胞。利用PEG的作用將其與同源的SP2/O骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,產(chǎn)生具有兩者特性即能產(chǎn)生抗體又能不斷生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞。三.細(xì)胞篩選以HAT、HT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞,去除非雜交瘤細(xì)胞。以間接ELISA法測(cè)定不同雜交瘤細(xì)胞上清反應(yīng)性,篩選出強(qiáng)陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞,然后利用有限稀釋法制備單克隆細(xì)胞株。根據(jù)該雜交瘤細(xì)胞所處的96孔板的位置命名所獲得的強(qiáng)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。四.抗體制備將產(chǎn)生的單克隆細(xì)胞培養(yǎng)至10~6個(gè)/ml后,接種于提前給予液體石蠟的小鼠腹腔,產(chǎn)生含有高效價(jià)的單克隆抗體的腹水并命名為抗眼鏡蛇毒腹水(anti-cobra venom ascites ACA)。五.活性鑒定1.以間接ELISA法檢測(cè)ACA,確定其抗體效價(jià)。2.利用不同的亞型抗體與ACA反應(yīng)性的差別,采用間接ELISA法檢測(cè)ACA的抗體亞型。3.應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)ACA的結(jié)合能力,確定其的親和力。4.以間接ELISA和雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同蛇毒和ACA的反應(yīng)性,確定ACA的種屬特異性及其與特異抗原的結(jié)合能力。5.用間接ELISA和雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ACA和NAV主要毒性成分的結(jié)合反應(yīng)能力,初步觀察ACA的減毒機(jī)制。6.用中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ACA對(duì)NAV急性毒性的影響,確定其對(duì)NAV的中和活性。7.用體內(nèi)保護(hù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ACA對(duì)NAV急性毒性的影響,觀察其對(duì)NAV中毒小鼠的治療作用。8.用中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ACA對(duì)眼鏡王蛇毒急性毒性的影響,觀察其對(duì)眼鏡王蛇毒的中和活性,了解ACA對(duì)眼鏡蛇科蛇毒的交叉反應(yīng)。研究結(jié)果一.建立一株產(chǎn)抗眼鏡蛇毒抗體的雜交瘤細(xì)胞株BE12B5本研究經(jīng)免疫小鼠、細(xì)胞融合、細(xì)胞篩選等實(shí)驗(yàn)流程,篩選出一株穩(wěn)定性好、分泌能力強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞株BE12B5,并制備出了高效價(jià)的抗眼鏡蛇毒腹水(ACA)。二.抗眼鏡蛇毒抗體的部分生物學(xué)表征經(jīng)檢測(cè),BE12B5細(xì)胞株上清的抗體效價(jià)可達(dá)1024,抗體亞型為lgG1,ACA效價(jià)大于400萬(wàn),親和力常數(shù)為2.0×10~(-7)L/mol。一般認(rèn)為親和力常數(shù)在10~(-8)~10~(-11)L/mol內(nèi)的單克隆抗體為高親和力,ACA具有較高的親和力。三.ACA的種屬特異性間接ELISA和雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ACA不僅對(duì)NAV有特異性的結(jié)合反應(yīng),對(duì)眼鏡王蛇毒亦具有較強(qiáng)的特異性結(jié)合反應(yīng),它們的結(jié)合能力和對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.0001)。ACA對(duì)銀環(huán)蛇毒、蝮蛇毒、蝰蛇毒、五步蛇毒則無(wú)特異性結(jié)合反應(yīng),它們的結(jié)合能力和對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。四.ACA體外與NAV混合對(duì)眼鏡蛇毒毒性的影響在體外中和實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)10ul(很低劑量)ACA與不同濃度的NAV混合后腹腔注射,能使NAV中毒小鼠死亡率降低,存活時(shí)間延長(zhǎng)。NAV的LD_(50)由1.623mg/kg上升至1.903mg/kg。以中和效價(jià)ED_(50)作為所得抗眼鏡蛇毒抗體的活性指標(biāo),計(jì)算ACA保護(hù)50%小鼠不死亡的每毫升抗蛇毒單抗所能中和的蛇毒質(zhì)量ACA的中和效價(jià)ED_(50)值為3.806mg/ml,95%可信區(qū)間為3.592~4.028mg/ml。五.ACA對(duì)NAV中毒小鼠的治療作用在體內(nèi)保護(hù)性實(shí)驗(yàn)中,10ul ACA腹腔注射使NAV中毒小鼠死亡率降低,小鼠的存活時(shí)間延長(zhǎng),眼鏡蛇毒的LD_(50)由1.623mg/kg上升至1.809mg/kg。ACA對(duì)NAV的治療效價(jià)ED_(50)值為3.618mg/ml,95%可信區(qū)間為3.302~3.958 mg/ml。六.ACA對(duì)眼鏡王蛇毒毒性影響在體外中和實(shí)驗(yàn)中,10ul ACA與不同濃度眼鏡王蛇毒混合后腹腔注射,可使眼鏡王蛇毒中毒小鼠的LD_(50)值由0.568mg/kg上升至0.695mg/kg,由此推算ACA對(duì)眼鏡王蛇毒中和效價(jià)ED_(50)為1.390mg/ml,95%可信區(qū)間為1.234~2.016mg/ml。結(jié)論本研究成功制備了一株穩(wěn)定性好的眼鏡蛇毒單克隆抗體細(xì)胞株BE12B5,并制備出了高效價(jià)的ACA。ACA為特異性抗眼鏡蛇毒單抗,具有較高的親和力,且它和NAV及其所含主要毒性成分─心臟毒素均具有強(qiáng)的反應(yīng)性。在體外可以中和眼鏡蛇毒,降低其毒性;在體內(nèi)具有減毒作用,對(duì)于NAV中毒小鼠具有治療作用,ACA對(duì)眼鏡王蛇毒具有一定的交叉中和作用,亦能降低其毒性。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【圖文】：

圖 2.1 免疫小鼠的血漿抗體效價(jià)Fig 2.1 The titer of anti-venom antibody in immunized mice plasma3.3 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選細(xì)胞融合后，先利用 HAT、HT 培養(yǎng)基篩選去除非雜交瘤細(xì)胞，后利用間接ELISA 篩選陽(yáng)性細(xì)胞。根據(jù) ELISA 數(shù)據(jù)，選擇 5 株陽(yáng)性高的雜交瘤細(xì)胞株（AE1BE12、DE9、EC8、EH11）進(jìn)行第一次有限稀釋。再根據(jù)第一次克隆化的陽(yáng)性率分析，BE12、AE1 細(xì)胞株陽(yáng)性較穩(wěn)定。從中再選擇 3 株（BE12B5、BE12B6、AE1B5雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行第二次有限稀釋。根據(jù)陽(yáng)性率分析，BE12B5 細(xì)胞株陽(yáng)性高且克隆化過(guò)程穩(wěn)定，故選擇第二次克隆化中效價(jià)最高的一株細(xì)胞株命名為 BE12B5。BE12B5 經(jīng)間接 ELISA 檢測(cè)，該細(xì)胞株上清的抗體效價(jià)為 1024。故經(jīng)過(guò)兩輪的有限稀釋，篩選出 1 株穩(wěn)定性好、效價(jià)高的雜交瘤細(xì)胞株 BE12B5。

福建醫(yī)科大學(xué)碩士論文表 2.3 細(xì)胞融合及克隆化過(guò)程的陽(yáng)性率Tab2.3 Positive rate of cell fusion and cloning process類(lèi)別細(xì)胞融合細(xì)胞株第 1 次克隆化細(xì)胞株 第 2 次克隆化細(xì)胞株AE1 BE12 DE9 EC8 EH11 BE12B5 BE12B6 AE1B5性率（%） 35 47.8 93.1 6.8 28.2 5.3 79.2 8.9 10.4

數(shù)據(jù)統(tǒng)一使用 SPSS17.0 軟件進(jìn)行分析，給藥前后采用配對(duì)樣本 T 檢驗(yàn)；各采用單因素的方差分析；數(shù)據(jù)主要采用 Graphpad Prism5 軟件做圖，P<0.05 說(shuō)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1 ACA 理化性質(zhì)的測(cè)定1.1 單克隆抗體亞型利用亞型抗體進(jìn)行間接 ELISA 測(cè)定細(xì)胞株 BE12B5 上清的抗體亞型。結(jié)果 4.1 顯示，BE12B5 上清對(duì) lgG1 反應(yīng)為強(qiáng)陽(yáng)性，則單克隆細(xì)胞株的抗體亞型G1，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.0001）。統(tǒng)計(jì)分析

【參考文獻(xiàn)】

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