【摘要】：目的:通過(guò)體外包裝高滴度PTPRR基因過(guò)表達(dá)和PTPRRsh RNA慢病毒顆粒,將病毒顆粒經(jīng)小鼠腦立體定位術(shù)注入小鼠海馬區(qū),構(gòu)造PTPRR基因過(guò)表達(dá)和沉默小鼠模型,比較基因過(guò)表達(dá)及基因沉默小鼠在懸尾實(shí)驗(yàn)、糖水實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中抑郁相關(guān)的行為變化,進(jìn)一步聯(lián)合慢性不可預(yù)知刺激(CMS)方法觀察小鼠抑郁行為的改變,初步探討動(dòng)物模型中PTPRR基因與抑郁發(fā)生的關(guān)系。方法:1.首先將已構(gòu)建成功的PTPRR基因過(guò)表達(dá)載體及空白對(duì)照載體GFP、PTPRRsh RNA載體及空白對(duì)照載體sh GFP,轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞進(jìn)行包裝,濃縮產(chǎn)生適用于體外實(shí)驗(yàn)的高滴度病毒顆粒。2.采用腦立體定位技術(shù)在小鼠海馬區(qū)微量注射慢病毒顆粒,從而引起小鼠海馬區(qū)PTPRR基因過(guò)表達(dá)及基因沉默,實(shí)驗(yàn)28天后取新鮮海馬組織,采用Western-blot、RT-PCR的方法分別檢測(cè)小鼠海馬區(qū)PTPRR蛋白及PTPRRm RNA表達(dá)改變。3.80只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為10組,每組8只,分別為:①Lenti-sh PTPRR(PTPRR基因沉默)組;②lenti-sh GFP(低表達(dá)空載體)組;③Lenti-PTPRR(PTPRR基因過(guò)表達(dá))組;④lenti-GFP(高表達(dá)空載體)組;⑤control(正常對(duì)照)組;⑥Lenti-sh PTPRR+CMS(PTPRR基因沉默干預(yù))組;⑦lenti-sh GFP+CMS(空載體干預(yù))組;⑧Lenti-PTPRR+CMS(PTPRR基因過(guò)表達(dá)干預(yù))組;⑨lenti-GFP+CMS(高表達(dá)空載體干預(yù))組;⑩control+CMS(正常對(duì)照干預(yù))組。小鼠術(shù)后1周,第⑥-⑩組進(jìn)行CMS干預(yù)21天后,觀察比較各組小鼠抑郁行為的變化。結(jié)果:1.成功建立具有特異性的PTPRR高表達(dá)及PTPRRsh RNA病毒包裝顆粒,病毒滴度達(dá)到1x109TU。2.注射病毒28天后發(fā)現(xiàn),Lenti-PTPRR組小鼠海馬組織PTPRRm RNA及蛋白水平與control組和Lenti-GFP組明顯增高(P0.001);Lenti-PTPRRsh RNA組小鼠海馬組織PTPRRm RNA及蛋白水平較control組和Lenti-sh GFP組明顯降低(P0.001);而Lenti-GFP組與control組兩組間比較,Lenti-sh GFP組與control組兩組間比較,PTPRRm RNA及蛋白水平無(wú)顯著性差異(P0.05)。3.在強(qiáng)迫游泳實(shí)中,各組間不動(dòng)時(shí)間具有顯著差異(F=28.823),Lenti-GFP組和control組兩組間T檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異;Lenti-sh GFP組和control組兩組間T檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異(P0.05);Lenti-PTPRR組分別與Lenti-GFP組進(jìn)行T檢驗(yàn),小鼠不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)(p0.05);Lenti-sh PTPRR組與Lenti-sh GFP進(jìn)行T檢驗(yàn),強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間無(wú)顯著性改變(P0.05);Lenti-PTPRR+CMS組與control+CMS組小鼠進(jìn)行T檢驗(yàn),強(qiáng)迫游泳時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P0.001);Lenti-sh PTPRR+CMS組與control+CMS組小鼠進(jìn)行T檢驗(yàn),強(qiáng)迫游泳時(shí)間明顯減少(P0.001)。4.在懸尾實(shí)驗(yàn)中,各組間具有顯著性差異(F=10.215),Lenti-GFP組和control組兩組間T檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異;Lenti-sh GFP組和control組兩組間T檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異(P0.05);Lenti-PTPRR組分別與Lenti-GFP組進(jìn)行T檢驗(yàn),小鼠不動(dòng)時(shí)間無(wú)明顯差異(p0.05);Lenti-sh PTPRR組與Lenti-sh GFP進(jìn)行T檢驗(yàn),不動(dòng)時(shí)間明顯減少(P0.05);Lenti-PTPRR+CMS組與control+CMS組小鼠進(jìn)行T檢驗(yàn),不動(dòng)時(shí)間無(wú)明顯改變(p0.05);Lenti-sh PTPRR+CMS組與control+CMS組小鼠進(jìn)行T檢驗(yàn),強(qiáng)迫游泳時(shí)間明顯減少(P0.001)。5.在糖水實(shí)驗(yàn)中,各組間存在顯著性差異(F=16.19),Lenti-GFP組和control組兩組間T檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異;Lenti-sh GFP組和control組兩組間T檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異(P0.05);Lenti-PTPRR組分別與Lenti-GFP組進(jìn)行T檢驗(yàn),小鼠糖水消耗率存在明顯降低,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);Lenti-sh PTPRR組與Lenti-sh GFP進(jìn)行T檢驗(yàn),糖水消耗率未有明顯改變,無(wú)統(tǒng)計(jì)差異(P0.05);Lenti-PTPRR+CMS組與control+CMS組小鼠進(jìn)行T檢驗(yàn),糖水消耗明顯降低,存在統(tǒng)計(jì)差異(p0.001);Lenti-sh PTPRR+CMS組與control+CMS組小鼠進(jìn)行T檢驗(yàn),糖水消耗明顯降低,統(tǒng)計(jì)具有差異(P0.001)。結(jié)論:1.成功包裝產(chǎn)生PTPRR過(guò)表達(dá)和PTPRRsh RNA高滴度慢病毒顆粒;2.成功建立PTPRR基因過(guò)表達(dá)和基因沉默小鼠模型;3.PTPRR過(guò)表達(dá)可以引起小鼠抑郁行為的增加,PTPRR基因過(guò)可能對(duì)于應(yīng)激更為敏感;4.PTPRR基因沉默可能會(huì)改善抑郁小鼠的絕望行為。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R-332;R749.4
【圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文2 結(jié) 果.1 PTPRR 基因過(guò)表達(dá)和 shRNA 病毒的包裝.1.1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)包裝病毒在 293T 細(xì)胞的表達(dá)經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)所包裝的 PTPRR 過(guò)表達(dá)病毒顆粒（圖中示：PTPRR 組）較其空白載體（圖中所示：GFP）在 293T 細(xì)胞中 PTPRRmRNA達(dá)明顯升高；包裝的四種 PTPRR 基因沉默病毒顆粒（圖中所示：shPTPRR1、hPTPRR2、shPTPRR3、shPTPRR4）較其空載體（圖中所示：shGFP 組）在 293T 細(xì)中 PTPRRmRNA 表達(dá)明顯降低。

20滴度：10-5滴度：10-6圖2-2 293T細(xì)胞免疫熒光結(jié)果(x20)2.2 PTPRR 基因過(guò)表達(dá)及基因沉默小鼠的驗(yàn)證2.2.1 小鼠海馬注射 28 后，海馬區(qū) PTPRRmRNA 的表達(dá)使用 RT-PCR 的方法檢測(cè)各組小鼠海馬區(qū) PTPRRmRNA 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lenti-GFP、Lenti-shGFP 與空白組比較，PTPRRmRNA 表達(dá)無(wú)顯著差異（P>0.05）

統(tǒng)計(jì)具有差異（p＜0.01）；PTPRR 基因過(guò)表達(dá)組小鼠較其空載體對(duì)照組小鼠，海馬區(qū) PTPRRmRNA 明顯下降，統(tǒng)計(jì)具有差異（p＜0.01）。圖2-3 病毒注射28后，PTPRRmRNA在小鼠海馬的表達(dá)2.2.2 小鼠海馬注射 28 后，海馬區(qū) PTPRR 蛋白的表達(dá)使用 Western-blot 的方法檢測(cè)各組小鼠海馬區(qū) PTPRR 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PTPRR 基因沉默組小鼠較其空載體對(duì)照組小鼠，Lenti-GFP、Lenti-shGFP 與空白組比較，PTPRRmRNA 表達(dá)無(wú)顯著差異（P>0.05）；海馬區(qū) PTPRR 蛋白水平明顯下降，統(tǒng)計(jì)具有差異（p＜0.01）；PTPRR 基因過(guò)表達(dá)組小鼠較其空載體對(duì)照組小鼠，海馬區(qū) PTPRR 蛋白水平明顯下降

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 石翠娟;張克讓;許琪;;受體型蛋白酪氨酸磷酸酶R基因多態(tài)性與重性抑郁障礙的關(guān)聯(lián)分析[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2011年06期

本文編號(hào)：2801477