發(fā)布時(shí)間：2020-08-23 08:55

【摘要】：牙本質(zhì)的形成起于顱神經(jīng)嵴來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)一系列細(xì)胞分化階段演變?yōu)槌裳辣举|(zhì)細(xì)胞，此過(guò)程受到多種信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)及轉(zhuǎn)錄因子和生長(zhǎng)因子的調(diào)控。已知BMP2為牙本質(zhì)發(fā)生發(fā)育所必需，DSPP是成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的重要標(biāo)志物，體外實(shí)驗(yàn)表明BMP2對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化具有調(diào)控作用。然而，BMP2在體內(nèi)牙本質(zhì)發(fā)育時(shí)期尤其在生后牙本質(zhì)形成過(guò)程中的具體作用尚不明確；BMP2經(jīng)由何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控DSPP基因表達(dá)的分子機(jī)制仍有待闡明。本研究應(yīng)用BMP2條件性基因敲除小鼠模型，在體評(píng)估BMP2對(duì)生后小鼠牙本質(zhì)形成的影響；并通過(guò)建立永生化成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞株，探討B(tài)MP2對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞DSPP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下： 1.BMP2條件性基因敲除導(dǎo)致小鼠生后牙本質(zhì)發(fā)育不全 本研究應(yīng)用Osx-cre小鼠模型條件性敲除牙本質(zhì)中的BMP2，探討B(tài)MP2在生后小鼠牙本質(zhì)形成中的調(diào)節(jié)作用。BMP2條件性基因敲除小鼠呈現(xiàn)廣泛而嚴(yán)重的異常牙齒表型并出現(xiàn)左右不對(duì)稱和分叉的切牙。X線及Micro-CT顯示切牙尖端破損，牙髓腔擴(kuò)大伴牙根形成障礙。切牙和磨牙的牙本質(zhì)層均變薄并伴有礦物質(zhì)過(guò)少。掃描電鏡分析顯示牙本質(zhì)表面粗糙不平，開(kāi)放牙本質(zhì)小管數(shù)量顯著減少，大多數(shù)牙本質(zhì)小管排列雜亂無(wú)序。以上結(jié)果表明BMP2為正常牙本質(zhì)形成所必需。 2.建立永生化成牙本質(zhì)樣細(xì)胞株 本研究從生后第三天小鼠下頜第一磨牙原代取材培養(yǎng)牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)染SV40T-Ag建立永生化細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以RT-PCR、免疫組織化學(xué)法加以鑒定，并分析其堿性磷酸酶活性和礦化結(jié)節(jié)的形成率。在這些永生化的細(xì)胞株當(dāng)中，有一株名為iMDP-3的細(xì)胞，顯示出高的增殖率及分化和形成礦化結(jié)節(jié)的能力,但同時(shí)保留了與原代培養(yǎng)的細(xì)胞相似的基因型和表型特征。此外，iMDP-3細(xì)胞還有高的轉(zhuǎn)染效率且能夠?yàn)锽MP2刺激所誘導(dǎo)并作出回應(yīng)。綜上我們得出結(jié)論，建立這樣一種穩(wěn)定的小鼠牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞株，或許能用以牙齒細(xì)胞分化和牙本質(zhì)形成的機(jī)制研究。 3. BMP2調(diào)控DSPP基因轉(zhuǎn)錄經(jīng)由Dlx3-Osx-GCN5信號(hào)通路介導(dǎo) 本研究中我們發(fā)現(xiàn)BMP2可通過(guò)上調(diào)iMDP-3磷酸化激酶Erk、Akt的活性誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Dlx3，Osx和組蛋白乙�；窯CN5的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)三種蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)位。利用凝膠阻滯遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）、抗體超遷移和寡核苷酸競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)以及染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)證明Dlx3、Osx能與DSPP基因啟動(dòng)子上特定結(jié)合位點(diǎn)相互作用。進(jìn)一步研究表明，過(guò)表達(dá)Dlx3和Osx可增強(qiáng)iMDP-3細(xì)胞中DSPP啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。免疫共沉淀（Co-IP）結(jié)果顯示Dlx3、Osx、GCN5之間存在蛋白與蛋白的相互作用。Re-ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)GCN5可與RNA聚合酶II共同結(jié)合于DSPP啟動(dòng)子。Western blot及ChIP實(shí)驗(yàn)提示BMP2可通過(guò)GCN5乙�；疍SPP核心啟動(dòng)子組蛋白H3并重塑染色質(zhì)。綜上結(jié)果表明BMP2調(diào)控DSPP基因表達(dá)和成牙本質(zhì)細(xì)胞分化經(jīng)由Dlx3-Osx-GCN5號(hào)通路所介導(dǎo)。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 高杰;吳補(bǔ)領(lǐng);何文喜;余擎;李萍;;Smad3對(duì)小鼠牙本質(zhì)涎磷蛋白啟動(dòng)子片段的調(diào)控[J];臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志;2008年08期

2 高杰;吳補(bǔ)領(lǐng);何文喜;余擎;李萍;;TGF-β1/Smad3信號(hào)途徑對(duì)牙本質(zhì)涎磷蛋白基因表達(dá)的調(diào)控[J];中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志;2008年03期

本文編號(hào)：2801335