【摘要】：目的:全世界范圍內(nèi),每年約有2000萬人感染瘧疾,死亡大約40萬人,其中死亡人數(shù)中70%發(fā)生在小于5歲的兒童。在瘧疾感染過程中嚴重的并發(fā)癥及腦瘧是造成患者死亡的主要原因,瘧原蟲的很多自身成分如瘧色素、核酸及瘧原蟲錨定蛋白(GPIs)均可誘發(fā)嚴重病理反應。GPIs為脂多糖復合體,很多細胞膜蛋白通過GPIs錨定于細胞膜發(fā)揮生物學功能。在瘧原蟲的各個發(fā)育階段均有GPIs表達,其中很多重要的GPIs蛋白的功能已經(jīng)被證明。在腦瘧發(fā)生過程中,GPIs可以刺激TNF-α及其他前炎癥因子的表達,從而誘發(fā)宿主嚴重的病理變化。瘧原蟲在蚊體內(nèi)階段,瘧原蟲本身的GPIs通過胰島素途徑誘導蚊體免疫細胞及內(nèi)皮細胞表達一氧化氮合酶(NOS),從而引起按蚊卵黃泡凋亡進而產(chǎn)卵量下降,減少能量消耗保證瘧原蟲在蚊體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育。在GPIs及其錨定蛋白轉(zhuǎn)運到細胞膜之前,錨定蛋白的GPI錨定信號肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過轉(zhuǎn)酰胺反應由GPIs替換,GPI轉(zhuǎn)酰胺酶(GPI-T)在這個修飾過程中發(fā)揮核心作用。GPI-T在各種生物體中保守表達,有5個亞基組成,在酵母等低等生物中,GPI-T包括Gaa1p,Gpi8p,Gpi17p Gpi16p及Gab1p,5種亞基形成2中亞復合體,由Gpi8p,Gpi16p及Gaa1p構(gòu)成的核心復合體發(fā)揮主要生物學功能與Gab1p及Gpi17p構(gòu)成的次要復合體。其中Gpi16p呈遞錨定蛋白與Gpi8p核心蛋白結(jié)合,同時Gpi16p調(diào)節(jié)Gpi8p與Gaa1p的表達。本課題的目的在于對瘧原蟲中GPI-T復合體進行相關研究,分別分析Pb GPI16缺失對瘧原蟲自身生長發(fā)育的影響,Pb GPI16缺失對中間宿主小鼠的影響以及Pb GPI16缺失對終宿主按蚊的影響。研究方法:1.生物信息學分析。Pb GPI16基因與其同源基因選于瘧原蟲數(shù)據(jù)庫Plasmo DB(http://www.plasmodb.org),蛋白信號肽及結(jié)構(gòu)域分析應用SMART在線預測(http://smart.emblheidelberg.de/).應用Clustal W進行同源性比對分析。2.基因重組蟲株建立.運用基因雙交叉同源重組技術構(gòu)建HA標簽蟲株及基因敲除蟲株,HA標簽蟲株(pbgpi16-ha)在Pb GPI16羧基末端融合HA標簽,基因敲除蟲株(△pbgpi16)利用hdhfr表達結(jié)構(gòu)代替全部pbgpi16編碼序列,基因重組蟲株均帶有乙胺嘧啶抗藥基因。3.Pb GPI16基因表達階段確定。pbgpi16-ha標簽蟲株用于檢測Pb GPI16表達階段,間接免疫熒光實驗(IFA)應用HA標簽蛋白單克隆抗體檢測pbgpi16-ha標簽蟲株HA標簽融合蛋白,Pb GPI16表達階段檢測包括環(huán)狀體、滋養(yǎng)體、裂殖體、雌雄配子體、雌雄配子、動合子及子孢子。4.基因敲除蟲株△pbgpi16表型檢測。健康BALB/c小鼠分別注射△pbgpi16感染紅細胞及野生型伯氏瘧原蟲Plasmodium berghei(WT-PbA)感染紅細胞,感染后吉姆薩染色檢測小鼠感染率,同時檢測小鼠死亡率變化。感染后第三天尾血吉姆薩染色檢測配子體率、雌雄配子體比,光鏡檢測尾血培養(yǎng)雄配子出絲情況。同時進行體外動合子形成實驗,利用Pbs21抗體檢測動合子形成,熒光顯微鏡下計數(shù)動合子。選取感染率相近小鼠進行直接模飼實驗,蚊子吸血10天后每組解剖不少于25只蚊子觀察蚊子感染率及感染蚊子卵囊密度,模飼實驗21天進行感染蚊子子孢子計數(shù),同時分別取△pbgpi16及WT-PbA子孢子10000只尾靜脈注射健康小鼠,觀察小鼠血液感染情況。4.△pbgpi16實驗性腦瘧模型(ECM)病例變化檢測。C57BL/6小鼠腹腔注射△pbgpi16或WT-PbA感染紅細胞,在小鼠表現(xiàn)出ECM癥狀時進行血腦屏障檢測試驗(BBB),分離感染小鼠腦組織進行蘇木素伊紅染色(HE)檢測腦內(nèi)微血管阻塞及血管內(nèi)皮損傷。免疫組組織化學染色檢測血管內(nèi)皮VCAM-1、ICAM-1及CD36表達情況。6.C57BL/6小鼠ECM細胞因子檢測。提取小鼠組織RNA,實時定量PCR(q RT-PCR)檢測小鼠腦組織中VCAM-1,ICAM-1,CD36,CXCL9,CXCL10及CXCR3 m RNA表達情況與小鼠脾組織中TNF-α,IFN-γ,TGF-β,IL-1β,IL-6,IL-10及IL-12m RNA表達情況。MSD檢測ECM小鼠血清中TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-6,IL-12,TGF-β及IL-10含量,酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中的TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-6,IL-12,TGF-β及IL-10含量。7.ECM中相關細胞檢測。運用流式細胞技術計數(shù)ECM小鼠腦組織中CD8陽性細胞數(shù)量,脾組織中1型輔助性T細胞(Th1)、樹突細胞(DCs)及調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)數(shù)量。8.ECM小鼠腦組織及脾組織NF-κB檢測。ECM小鼠分離脾細胞及腦中的淋巴細胞,提取細胞核蛋白,免疫印跡實驗(western blot)實驗檢測細胞核內(nèi)NF-κB含量。9.△pbgpi16感染按蚊產(chǎn)卵量檢測。分別取4至6天蚊齡的按蚊50至100只,分別吸取WT PbA感染小鼠、△pbgpi16感染小鼠及健康小鼠的血液。吸血3天后進行產(chǎn)卵量計數(shù),產(chǎn)卵量計數(shù)包括產(chǎn)卵數(shù)及解剖蚊體后蚊體內(nèi)成熟的蚊卵。10.△pbgpi16感染按蚊凋亡相關基因檢測。按蚊吸血后24小時,每組取5只吸血的蚊子,提取蚊子總RNA,q RT-PCR檢測As NOS、As INR表達情況。11.統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)均采用均值加減標準差分析,采用Kaplan-Meier log-rank檢驗進行生存分析,Student's t-test或者one-way ANOVA進行顯著性差異分析,取p值小于0.05為顯著差異。結(jié)果:1.Pb GPI16表達于P.berghei各個階段并在各種瘧原蟲中高度保守。生物信息學分析表明Pb GPI16蛋白N端含有保守信號肽,靠近C端含有一個GPI轉(zhuǎn)酰胺酶亞基16(Gpi16)機構(gòu)域。根據(jù)Clustal W同源性比對發(fā)現(xiàn)Pb GPI16在瘧原蟲各種屬中高度保守表達。IFA檢測Pb GPI16表達階段,熒光信號在瘧原蟲各個階段均有檢出,包括環(huán)狀體、滋養(yǎng)體、裂殖體、雌雄配子體、雌雄配子、動合子及子孢子。2.Pb GPI16缺失瘧原蟲侵襲紅細胞能力下降并影響蚊內(nèi)階段發(fā)育�！鱬bgpi16感染小鼠瘧原蟲感染率低于WT PbA感染小鼠,配子體率及雌雄配子體比無明顯變化,雄配子出絲能力正常,但體外動合子培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示△pbgpi16形成動合子數(shù)量明顯少于WT PbA。直接模飼實驗顯示按蚊感染率無明顯變化,但感染△pbgpi16按蚊卵囊密度相比WT PbA組明顯降低,模飼實驗21天子孢子計數(shù)△pbgpi16組子孢子數(shù)量相比WT PbA組顯著減少。但小鼠尾靜脈注射△pbgpi16子孢子可致小鼠感染。3.△pbgpi16感染C57BL/6小鼠腦瘧病理變化減輕。WT PbA感染小鼠于感染后第6天表現(xiàn)出明顯腦瘧神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,多于感染后5至12天死亡,而△pbgpi16感染小鼠很少表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,多數(shù)小鼠死于感染12天后。BBB實驗顯示△pbgpi16感染小鼠血腦屏障破壞減輕,HE染色顯示△pbgpi16感染小鼠腦內(nèi)白細胞浸潤血管數(shù)量明顯少于WT PbA感染小鼠,同時血管內(nèi)皮VCAM-1、ICAM-1及CD36表達明顯減少,q TR-PCR顯示腦內(nèi)與腦瘧發(fā)生相關的趨化因子CXCL9,CXCL10及CXCR3表達降低。4.△pbgpi16感染C57BL/6小鼠前炎癥反應下降�！鱬bgpi16感染小鼠TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-6及IL-12表達量明顯下降,同時脾中的Th1淋巴細胞及腦中的CD8~+淋巴細胞數(shù)量明顯少于WT PbA感染小鼠。脾中表達MHCII及TLR-4的DCs細胞數(shù)量亦有明顯下降,但IL-10與TGF-β抑炎癥因子及Treg細胞數(shù)量表達相對升高。5.△pbgpi16感染C57BL/6小鼠NF-κB途徑未活化�！鱬bgpi16感染小鼠6天后,Western blot檢測小鼠脾細胞及腦淋巴細胞細胞核內(nèi)NF-κB表達,結(jié)果顯示△pbgpi16感染組細胞核內(nèi)NF-κB表達明顯低于WT PbA組,結(jié)果提示△pbgpi16感染小鼠免疫細胞包漿內(nèi)NF-κB未能激活進入細胞核內(nèi)調(diào)控后續(xù)相關基因的表達。6.Pb GPI16缺失瘧原蟲感染按蚊抑制卵巢凋亡�！鱬bgpi16感染按蚊產(chǎn)卵量明顯高于WT PbA感染按蚊。按蚊感染瘧原蟲后,瘧原蟲GPIs激活外源性胰島素途徑促使NOS表達,進而激活按蚊體內(nèi)凋亡途徑�！鱬bgpi16感染按蚊As NOS表達量明顯低于WT PbA感染按蚊。結(jié)論:1:Pb GPI16表達于瘧原蟲各個階段并在各種瘧原蟲中高度保守2:Pb GPI16缺失影響瘧原蟲侵襲紅細胞及蚊體內(nèi)發(fā)育3:Pb GPI16在ECM中發(fā)揮關鍵作用4:Pb GPI16缺失不能激活按蚊自身細胞凋亡途徑
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R382.31
【圖文】：

圖 2：GPI-T 復合體轉(zhuǎn)酰胺反應示意圖。GPI-T 在各種生物體中保守表達，在人類細胞中，GPI-T 有由 5 個亞基組成，包括 GAA1、GPI8、PIG-S、PIG-T 及 PIG-U，在酵母等低等生物中，GPI-T 包括Gaa1p, Gpi8p, Gpi17p Gpi16p 及 Gab1p（圖 3）[42, 43]。5 種亞基形成 2 中亞復合體，由 Gpi8p, Gpi16p 及 Gaa1p 構(gòu)成的核心復合體發(fā)揮主要生物學功能與 Gab1p及 Gpi17p 構(gòu)成的次要復合體[44]。其主要復合體中，Gaa1p 為多次跨膜蛋白，鑲嵌在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，Gpi8p 與 Gpi16p 均為單次跨膜蛋白，嵌插于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，二者之間通過二硫鍵連接，同時與 Gaa1p 結(jié)合形成復合體結(jié)構(gòu)。Gpi8p 在整個復合體中發(fā)揮酶催化作用，與 Gaa1p 共同完成轉(zhuǎn)酰胺反應，其中 Gpi16p 呈遞錨定蛋白與 Gpi8p 核心蛋白結(jié)合[45]，同時 Gpi16p 調(diào)節(jié) Gpi8p 與 Gaa1p 的表達[9]。

圖 3：人類及低等生物中 GPI-T 復合體各亞基組成。其中標記為紅色亞基為 PbGPI16 同源亞基。以上理論基礎，目前尚未有關于瘧原蟲 GPI-T 復合體的研究報基于研究瘧原蟲中 GPI-T 復合體的生物信息學分析確認了 Pb蟲中 GPI-T 復合體中的亞基之一，對 PbGPI16 的表達階段進行研究了 PbGPI16 缺失對伯氏瘧原蟲各個發(fā)育階段的影響。

3.1 伯氏瘧原蟲 GPI-T 組成經(jīng)生物信息學分析，伯氏瘧原蟲中 GPI-T 包含 GPI8、GPAA1 及 GPI16 組成，其中 PbGPI8 含有 462 個氨基酸，蛋白 C 端還有信號肽序列，還有一個跨膜區(qū)及一個轉(zhuǎn)酰胺 C13 超家族結(jié)構(gòu)。PbGPAA1 包含 755 個氨基酸，蛋白包含 6 個跨膜結(jié)構(gòu)及一個 GPI-T 復合體 GPAA1 亞基結(jié)構(gòu)域。PbGPI16 包含 512 個氨基酸，蛋白C端還有一個信號肽序列，N端含有一個跨膜區(qū)，另外靠近N端還有一個GPI-T復合體 GPI16 亞基結(jié)構(gòu)域。PbGPI8、PbGPAA1 及 PbGPI16 蛋白結(jié)構(gòu)與酵母等低級生物中 GPI-T 主要復合體相似，即 GPI8 與 GPI16 均為單次跨膜蛋白，二者通過二硫鍵連接，GPAA1 為多次跨膜蛋白鑲嵌于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，與 GPI8 及 GPI16 共同發(fā)揮生物學作用 (圖 4)。3 結(jié)果

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本文編號：2800462