發(fā)布時(shí)間：2020-08-22 00:57

【摘要】：帕金森病(PD,Parkinson disease's)是老年人黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元中樞性進(jìn)行性神經(jīng)退化性疾病,其病理生理機(jī)制與黑質(zhì)致密部多種神經(jīng)系統(tǒng)的改變有關(guān)。帕金森病臨床癥狀可出現(xiàn)靜止性震顫、肌強(qiáng)直等,主要病理特征是黑質(zhì)含色素的多巴胺能神經(jīng)元丟失,殘存的神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)嗜酸性包涵體路易小體(Lewy),α-突觸核蛋白(α-synuclein)是路易小體的主要組成部分,它是一種幼稚的蛋白泛素化包括中樞神經(jīng)核周體及路易蛋白,與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中蛋白合體相似,αa-synuclein的三倍基因體SNCA在早期帕金森病合并癡呆中被發(fā)現(xiàn)。帕金森病真正的病因尚不明確,但很多研究顯示凋亡引起中樞神經(jīng)神經(jīng)元退化是其中一個(gè)重要的機(jī)制,治療主要是通過美多巴、多巴胺受體激動(dòng)劑、膽堿酯酶抑制劑等改善臨床癥狀,并不能阻止多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞凋亡或提高受損的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的功能。此外,長期應(yīng)用也會(huì)導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)。因此,當(dāng)務(wù)之急是能夠研究出一種能夠推遲、干預(yù)、甚至是阻止多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞退化,治療帕金森的新藥。京尼平苷(Geniposide,GP)是一種重要的環(huán)烯醚萜類化合物,取自中藥梔子,在中國傳統(tǒng)藥書中出現(xiàn),用來治療肝癌、感染、外傷、腦部疾病等。有報(bào)道顯示:京尼平苷在MPTP誘導(dǎo)的帕金森大鼠模型中具有中樞神經(jīng)腦保護(hù)作用。它的腦保護(hù)作用在其他疾病中也有報(bào)道,比如阿爾茨海默病,可能與通過RAGE信號(hào)通路有關(guān)。microRNAs(miRNAs)越來越受到認(rèn)可與重視,它能調(diào)控基因表達(dá)、調(diào)控基因事件的發(fā)生,選擇相應(yīng)靶點(diǎn)并參與許多病理生理反應(yīng)過程,機(jī)制可能與參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。miRNA-21(miR-21)可以通過靶向細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡作用并通過誘導(dǎo)FAS配體來保護(hù)神經(jīng)元免于死亡,有報(bào)道示:miR-21可能通過S100/RAGE信號(hào)通路發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用,基于RAGE信號(hào)通路參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用,我們研究miR-21在帕金森病中的作用。帕金森病和阿爾茨海默病一樣,是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病。研究顯示,miR-21可作用于溶酶體相關(guān)膜蛋白2A(LAMP2A),高表達(dá)的miR-21可明顯降低PD模型中LAMP2A的表達(dá),LAMP2A可以導(dǎo)致分子伴侶介導(dǎo)的自噬活動(dòng)增加,CMA是減少α-synuclein蛋白的重要信號(hào)通路,但是京尼平苷對(duì)帕金森病腦保護(hù)作用是否與通過調(diào)節(jié)miR-21的表達(dá)有關(guān)尚不清楚。在本研究中,通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究來探討京尼平苷對(duì)帕金森病大鼠模型的的腦保護(hù)作用潛在的具體機(jī)制,來探討京尼平苷在帕金森病模型中神經(jīng)保護(hù)作用。第一部分建立穩(wěn)定的帕金森病細(xì)胞模型方法:1,用不同濃度MPP+(OmM、1mM、2mM、4mM)誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞作用時(shí)間持續(xù)48小時(shí);選擇合適的MPP+濃度來建立急性PD細(xì)胞模型;2,用Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè);3,針對(duì)已建立的PD細(xì)胞模型,用乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)試劑盒檢測(cè)乳酸脫氫酶表達(dá)水平。4,用活性氧(Reactive oxygen species,ROS)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量;結(jié)果1,用不同濃度的MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞,細(xì)胞的損傷隨其濃度的增加活性明顯下降;2,用濃度1mM的MPP+的來建立急性帕金森病細(xì)胞模型:3,以濃度為1mM的MPP+作用于SH-SY5Y細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)含量明顯增加;4,以濃度為1mM的MPP+作用于SH-SY5Y細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)LDH釋放含量明顯增加;結(jié)論采用濃度為1mM的MPP+作用于SH-SY5Y細(xì)胞,可極大地對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生影響,促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)活性氧、乳酸脫氫酶的生成,可建立穩(wěn)定的急性帕金森病細(xì)胞模型。第二部分探討京尼平苷對(duì)帕金森病細(xì)胞模型中miR-21、LAMP2A、α-synuclein表達(dá)水平的影響方法1,MPP+誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞建立穩(wěn)定的帕金森病模型,梔子苷處理用MPP+預(yù)處理的人神胞瘤細(xì)胞系經(jīng)母細(xì)SHSY5Y,采用qRT-PCR和Western bloting方法檢測(cè)miR-21、LAMP2A和α-synuclein的mRNA和蛋白水平。2,分別用 miR-21 mimic 和 miR-21 inhibitor 轉(zhuǎn)染 MPP+預(yù)處理的 SHSY5Y細(xì)胞(即細(xì)胞PD模型),測(cè)定LAMP2A、α-synuclein的mRNA和蛋白表達(dá)水平,以明確miR-21對(duì)LAMP2A、α-synuclein調(diào)控作用。3,分別用 miR-21 mimic 和 miR-21 inhibitor 處理 GP 預(yù)處理的 SHSY5Y 細(xì)胞,測(cè)定LAMP2A、α-synuclein的mRNA和蛋白水平,同時(shí)通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)miR-21是否直接靶向LAMP2A調(diào)控其表達(dá),以確定GP能否通過miR-21/LAMP2A 減少αα-synuclein 表達(dá)水平。結(jié)果1.miR-21在模型組表達(dá)高于正常對(duì)照細(xì)胞組,京尼平苷可明顯下調(diào)miR-21表達(dá);提高LAMP2A蛋白和基因表達(dá)水平,降低了α-synuclein在帕金森模型組表達(dá)。2.過度表達(dá)的LAMP2A可抑制miR-21上調(diào)α-synuclein的水平。3.miR-21 mimic可逆轉(zhuǎn)京尼平苷對(duì)α-synuclein的下調(diào);miR-21 inhibitor可明顯增強(qiáng)京尼平苷下調(diào)α-synuclein表達(dá)水平;miR-21可直接靶向LAMP2A,有效地降低其mRNA水平。結(jié)論京尼平苷降低α-synuclein表達(dá)水可能通過降低miR-21表達(dá)、提高LAMP2A蛋白和基因表達(dá)水平有關(guān);第三部分構(gòu)建體外帕金森病小鼠模型,探討GP對(duì)小鼠PD模型中miR-21、LAMP2A和α-synuclein表達(dá)水平的影響方法通過腹腔注射MPTP建立帕金森小鼠模型,小鼠隨機(jī)分為:生理鹽水、MPTP、MPTP+GP、MPTP+GP+miR-21 agomir四組。檢測(cè)不同組別小鼠中腦黑質(zhì)中TH+神經(jīng)元體視學(xué)計(jì)數(shù);qRT-PCR、Western blot 測(cè)定 miR-21、LAMP2A 和α-synuclein mRNA和蛋白變化。結(jié)果1.MPTP顯著減少TH+細(xì)胞數(shù),GP可減輕MPTP對(duì)中腦中多巴胺能神經(jīng)元的損害;2.miR-21 agomir可抑制GP引起的TH+細(xì)胞數(shù)的增加。3.高表達(dá)的miR-21可有效地逆轉(zhuǎn)GP上調(diào)LAMP2A水平,下調(diào)α-synuclein表達(dá)水平;結(jié)論:帕金森病動(dòng)物模型中,京尼平苷腦保護(hù)作用可能通過影響miR-21/LAMP2A的表達(dá),進(jìn)而下調(diào)α-synuclein表達(dá)水平有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R965;R-332
【圖文】：

第一部分建立穩(wěn)定的帕金森病細(xì)胞模型分組、做好標(biāo)記。檢測(cè)前ｌｈ，在物藥物處理細(xì)胞１０％的ＬＤＨ釋放試劑，反復(fù)吹打后，繼續(xù)進(jìn)孵育，各孔的上清液約１２０｜ｘＬ，加入所需培養(yǎng)板中待測(cè)ＭＰＰ＋作用于ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細(xì)胞時(shí)所造成的損傷結(jié)驗(yàn)結(jié)果觀察示：ＭＰＰ＋對(duì)ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細(xì)胞的損傷程度，ＰＰＴ濃度的增加而增加，當(dāng)ＭＰＰ＋濃度為２ｍＭ、４ｍ至５０％以下，因此選ＩｍＭ作為給藥濃度，建立穩(wěn)ＭＰＰ邋＋逡逑

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1 劉海林;徐江濤;宋永斌;楊俊;許永華;余伍忠;李景春;張子彥;;慢性間斷性缺氧對(duì)帕金森病模型小鼠認(rèn)知功能的影響[J];新醫(yī)學(xué);2011年06期

2 張揚(yáng);邵蓓;;茶多酚對(duì)帕金森病模型小鼠多巴胺神經(jīng)元保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國康復(fù)理論與實(shí)踐;2008年03期

3 李燕

本文編號(hào)：2800062