【摘要】：帕金森病(PD,Parkinson disease's)是老年人黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元中樞性進行性神經(jīng)退化性疾病,其病理生理機制與黑質(zhì)致密部多種神經(jīng)系統(tǒng)的改變有關(guān)。帕金森病臨床癥狀可出現(xiàn)靜止性震顫、肌強直等,主要病理特征是黑質(zhì)含色素的多巴胺能神經(jīng)元丟失,殘存的神經(jīng)細胞質(zhì)中出現(xiàn)嗜酸性包涵體路易小體(Lewy),α-突觸核蛋白(α-synuclein)是路易小體的主要組成部分,它是一種幼稚的蛋白泛素化包括中樞神經(jīng)核周體及路易蛋白,與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中蛋白合體相似,αa-synuclein的三倍基因體SNCA在早期帕金森病合并癡呆中被發(fā)現(xiàn)。帕金森病真正的病因尚不明確,但很多研究顯示凋亡引起中樞神經(jīng)神經(jīng)元退化是其中一個重要的機制,治療主要是通過美多巴、多巴胺受體激動劑、膽堿酯酶抑制劑等改善臨床癥狀,并不能阻止多巴胺能神經(jīng)元細胞凋亡或提高受損的多巴胺能神經(jīng)元細胞的功能。此外,長期應(yīng)用也會導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)。因此,當務(wù)之急是能夠研究出一種能夠推遲、干預(yù)、甚至是阻止多巴胺神經(jīng)元細胞退化,治療帕金森的新藥。京尼平苷(Geniposide,GP)是一種重要的環(huán)烯醚萜類化合物,取自中藥梔子,在中國傳統(tǒng)藥書中出現(xiàn),用來治療肝癌、感染、外傷、腦部疾病等。有報道顯示:京尼平苷在MPTP誘導(dǎo)的帕金森大鼠模型中具有中樞神經(jīng)腦保護作用。它的腦保護作用在其他疾病中也有報道,比如阿爾茨海默病,可能與通過RAGE信號通路有關(guān)。microRNAs(miRNAs)越來越受到認可與重視,它能調(diào)控基因表達、調(diào)控基因事件的發(fā)生,選擇相應(yīng)靶點并參與許多病理生理反應(yīng)過程,機制可能與參與神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)。miRNA-21(miR-21)可以通過靶向細胞發(fā)揮抗凋亡作用并通過誘導(dǎo)FAS配體來保護神經(jīng)元免于死亡,有報道示:miR-21可能通過S100/RAGE信號通路發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用,基于RAGE信號通路參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護作用,我們研究miR-21在帕金森病中的作用。帕金森病和阿爾茨海默病一樣,是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病。研究顯示,miR-21可作用于溶酶體相關(guān)膜蛋白2A(LAMP2A),高表達的miR-21可明顯降低PD模型中LAMP2A的表達,LAMP2A可以導(dǎo)致分子伴侶介導(dǎo)的自噬活動增加,CMA是減少α-synuclein蛋白的重要信號通路,但是京尼平苷對帕金森病腦保護作用是否與通過調(diào)節(jié)miR-21的表達有關(guān)尚不清楚。在本研究中,通過體內(nèi)體外實驗研究來探討京尼平苷對帕金森病大鼠模型的的腦保護作用潛在的具體機制,來探討京尼平苷在帕金森病模型中神經(jīng)保護作用。第一部分建立穩(wěn)定的帕金森病細胞模型方法:1,用不同濃度MPP+(OmM、1mM、2mM、4mM)誘導(dǎo)人神經(jīng)母細胞瘤細胞作用時間持續(xù)48小時;選擇合適的MPP+濃度來建立急性PD細胞模型;2,用Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒對細胞活性進行檢測;3,針對已建立的PD細胞模型,用乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)試劑盒檢測乳酸脫氫酶表達水平。4,用活性氧(Reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)活性氧含量;結(jié)果1,用不同濃度的MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞,細胞的損傷隨其濃度的增加活性明顯下降;2,用濃度1mM的MPP+的來建立急性帕金森病細胞模型:3,以濃度為1mM的MPP+作用于SH-SY5Y細胞,細胞內(nèi)ROS表達含量明顯增加;4,以濃度為1mM的MPP+作用于SH-SY5Y細胞,細胞內(nèi)LDH釋放含量明顯增加;結(jié)論采用濃度為1mM的MPP+作用于SH-SY5Y細胞,可極大地對細胞活性產(chǎn)生影響,促進了細胞內(nèi)活性氧、乳酸脫氫酶的生成,可建立穩(wěn)定的急性帕金森病細胞模型。第二部分探討京尼平苷對帕金森病細胞模型中miR-21、LAMP2A、α-synuclein表達水平的影響方法1,MPP+誘導(dǎo)人神經(jīng)母細胞瘤細胞建立穩(wěn)定的帕金森病模型,梔子苷處理用MPP+預(yù)處理的人神胞瘤細胞系經(jīng)母細SHSY5Y,采用qRT-PCR和Western bloting方法檢測miR-21、LAMP2A和α-synuclein的mRNA和蛋白水平。2,分別用 miR-21 mimic 和 miR-21 inhibitor 轉(zhuǎn)染 MPP+預(yù)處理的 SHSY5Y細胞(即細胞PD模型),測定LAMP2A、α-synuclein的mRNA和蛋白表達水平,以明確miR-21對LAMP2A、α-synuclein調(diào)控作用。3,分別用 miR-21 mimic 和 miR-21 inhibitor 處理 GP 預(yù)處理的 SHSY5Y 細胞,測定LAMP2A、α-synuclein的mRNA和蛋白水平,同時通過熒光素酶報告實驗檢驗miR-21是否直接靶向LAMP2A調(diào)控其表達,以確定GP能否通過miR-21/LAMP2A 減少αα-synuclein 表達水平。結(jié)果1.miR-21在模型組表達高于正常對照細胞組,京尼平苷可明顯下調(diào)miR-21表達;提高LAMP2A蛋白和基因表達水平,降低了α-synuclein在帕金森模型組表達。2.過度表達的LAMP2A可抑制miR-21上調(diào)α-synuclein的水平。3.miR-21 mimic可逆轉(zhuǎn)京尼平苷對α-synuclein的下調(diào);miR-21 inhibitor可明顯增強京尼平苷下調(diào)α-synuclein表達水平;miR-21可直接靶向LAMP2A,有效地降低其mRNA水平。結(jié)論京尼平苷降低α-synuclein表達水可能通過降低miR-21表達、提高LAMP2A蛋白和基因表達水平有關(guān);第三部分構(gòu)建體外帕金森病小鼠模型,探討GP對小鼠PD模型中miR-21、LAMP2A和α-synuclein表達水平的影響方法通過腹腔注射MPTP建立帕金森小鼠模型,小鼠隨機分為:生理鹽水、MPTP、MPTP+GP、MPTP+GP+miR-21 agomir四組。檢測不同組別小鼠中腦黑質(zhì)中TH+神經(jīng)元體視學(xué)計數(shù);qRT-PCR、Western blot 測定 miR-21、LAMP2A 和α-synuclein mRNA和蛋白變化。結(jié)果1.MPTP顯著減少TH+細胞數(shù),GP可減輕MPTP對中腦中多巴胺能神經(jīng)元的損害;2.miR-21 agomir可抑制GP引起的TH+細胞數(shù)的增加。3.高表達的miR-21可有效地逆轉(zhuǎn)GP上調(diào)LAMP2A水平,下調(diào)α-synuclein表達水平;結(jié)論:帕金森病動物模型中,京尼平苷腦保護作用可能通過影響miR-21/LAMP2A的表達,進而下調(diào)α-synuclein表達水平有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R965;R-332
【圖文】：

第一部分建立穩(wěn)定的帕金森病細胞模型分組、做好標記。檢測前ｌｈ，在物藥物處理細胞１０％的ＬＤＨ釋放試劑，反復(fù)吹打后，繼續(xù)進孵育，各孔的上清液約１２０｜ｘＬ，加入所需培養(yǎng)板中待測ＭＰＰ＋作用于ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞時所造成的損傷結(jié)驗結(jié)果觀察示：ＭＰＰ＋對ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞的損傷程度，ＰＰＴ濃度的增加而增加，當ＭＰＰ＋濃度為２ｍＭ、４ｍ至５０％以下，因此選ＩｍＭ作為給藥濃度，建立穩(wěn)ＭＰＰ邋＋逡逑

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本文編號：2800062