【摘要】：第一章早期培養(yǎng)對(duì)人類胚胎干細(xì)胞(hESCs)遺傳穩(wěn)定和基因表達(dá)的影響 目的：既往的研究發(fā)現(xiàn)在長期培養(yǎng)的hESCs(P30)中會(huì)發(fā)生一些遺傳和表觀遺傳的改變,然而,對(duì)于P30以前是否也發(fā)生了一些改變目前知之甚少,我們的研究目的在于利用我們胚胎干細(xì)胞庫的豐富資源,評(píng)估hESCs在分離后的早期培養(yǎng)過程(20代以前)的遺傳學(xué)改變和基因表達(dá)的改變。 材料和方法：利用我們胚胎干細(xì)胞庫的胚胎干細(xì)胞資源,分別選取核型正常的分離初始期(P4-P9)和早期(P20-P30)hESCs,其中5株進(jìn)行SNP芯片用于分析遺傳變化,12株行全基因組表達(dá)譜芯片用于分析基因表達(dá)變化。 結(jié)果：從我們選取的細(xì)胞庫中核型正常,并已完成各項(xiàng)檢查的12株hESCs的初始期和早期未分化樣本進(jìn)行的以上實(shí)驗(yàn)可得到以下結(jié)果(1)SNP芯片分析結(jié)果可知,有一些小片段的缺失和重復(fù),這些片段的平均大小約為100kb,且不存在規(guī)律性的改變。(2)從表達(dá)譜的分析來看,在兩個(gè)階段的樣本間平均僅有0.10士0.09%的基因(檢測(cè)的38500基因中有12-136個(gè)發(fā)生改變)發(fā)生顯著性改變(2-fold, t-test,P0.05)。(3)兩個(gè)階段樣本間共同的的變化是早期女性樣本中XIST基因的沉默和早期大部分樣本中DLK1-DIO3印記區(qū)域中相關(guān)轉(zhuǎn)錄子的沉默,以MEG3, SNORD114-3為代表。 結(jié)論：在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的早期階段,遺傳物質(zhì)未發(fā)生顯著的規(guī)律性改變,而從轉(zhuǎn)錄水平來看,基因表達(dá)整體變化較小,但存在共同的差異：XIST基因和IOLK1-DIO3印記區(qū)域在早期hESCs中的沉默。 第二章生理氧培養(yǎng)能阻止hESCs早期培養(yǎng)階段普遍發(fā)生的DLK1-DIO3印記區(qū)的異常沉默 目的：DLK1-DIO3印記區(qū)是一個(gè)進(jìn)化上保守的印記區(qū)域,位于人類14號(hào)染色體(14q32),在小鼠中的研究發(fā)現(xiàn),在小鼠iPS細(xì)胞重編程過程易發(fā)生Dlk1-Dio3印記區(qū)的異常沉默,其沉默損害了iPS在四倍體囊胚補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)中形成完全iPS來源的成體小鼠的能力。基于第一章中DLK1-DIO3印記區(qū)在早期hESCs中易發(fā)生沉默的現(xiàn)象,回答以下問題：1,DLK1-DIO3印記區(qū)編碼的其他小RNA是否受MEG3沉默的影響,2,確定第一章中DLK1-DIO3記區(qū)的沉默是一種普遍現(xiàn)象還是個(gè)例,3,該印記區(qū)沉默的調(diào)控機(jī)制,4,初始期的hESCs是否是一種正常的印記狀態(tài),5,沉默是什么原因引起的以及對(duì)hESCs分化能力是否有影響? 材料和方法：1,在配對(duì)的初始期和早期hESCs中,采用small RNA深度測(cè)序方法對(duì)DLK1-DIO3印記區(qū)編碼的其他小RNA(包括niRNAs和snoRNAs)的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。2,利用Real-time PCR方法檢測(cè)了細(xì)胞庫中更多細(xì)胞系中DLK1-DIO3印記區(qū)的表達(dá)狀態(tài),同時(shí)利用GEO數(shù)據(jù)庫,利用生物信息學(xué)評(píng)估了國際上常用的hESCs及一些hiPSC系中該印記區(qū)的表達(dá)狀態(tài)。3,DLK1-DIO3印記區(qū)受DLK1和MEG3間的基因間差異甲基化區(qū)域和MEG3啟動(dòng)子區(qū)域的差異甲基化區(qū)域所調(diào)控,采用亞硫酸鹽測(cè)序的方法對(duì)這些調(diào)控區(qū)域的甲基化狀態(tài)進(jìn)行了評(píng)估。4,利用MEG3外顯子區(qū)域的SNP位點(diǎn),通過對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序,對(duì)MEG3的表達(dá)模式(單等位或雙等位)進(jìn)行了分析。5,針對(duì)第一章中確定發(fā)生沉默的細(xì)胞系,采用體內(nèi)外分化實(shí)驗(yàn)(EB和畸胎瘤實(shí)驗(yàn))對(duì)沉默前后的hESCs進(jìn)行了分化能力的分析,并分析了分化能否逆轉(zhuǎn)MEG3的沉默。6,針對(duì)DLK1-DIO3在部分細(xì)胞系中不發(fā)生沉默著手,提出了氧濃度可能是影響該印記區(qū)活化狀態(tài)的關(guān)鍵因素的推斷,通過在生理氧分離、培養(yǎng)新的細(xì)胞系檢測(cè)MEG3活性和相關(guān)調(diào)控區(qū)域的甲基化狀態(tài)對(duì)該推斷進(jìn)行了驗(yàn)證。7,將大氣氧條件分離的hESCs在初始期階段轉(zhuǎn)入生理氧條件長期培養(yǎng),Real-timePCR檢測(cè)分析其能否阻止MEG3的發(fā)生沉默。 結(jié)果：1,在hESCs早期培養(yǎng)過程,DLK1-DIO3印記區(qū)的沉默還包括該區(qū)域編碼的miRNAs(?)snoRNAs的沉默。2,從我們實(shí)驗(yàn)室和國際上其他實(shí)驗(yàn)室更多多能性細(xì)胞系的分析結(jié)果可知,DLK1-DIO3印記區(qū)的沉默是多能性干細(xì)胞(包括hESCs和iPS)在常規(guī)培養(yǎng)條件下極其常見的表觀遺傳改變。3.MEG3的沉默伴隨著MEG3啟動(dòng)子區(qū)域和MEG3、DLK1基因間調(diào)控區(qū)域的高度甲基化。4.hESCs培養(yǎng)初始期是單等位表達(dá)模式,為正常的印記狀態(tài)。5,從hESCs分化能力來看,該印記區(qū)沉默后,仍具有體內(nèi)外多向分化潛能,但分化后,沉默的MEG3不會(huì)被激活；6,大氣氧的分離和培養(yǎng)是引起該印記區(qū)沉默的關(guān)鍵因素,生理氧分離和培養(yǎng)能維持該印記區(qū)的活化狀態(tài)。7,大氣氧濃度分離的初始期hESCs轉(zhuǎn)入生理氧濃度培養(yǎng)不能逆轉(zhuǎn)MEG3的沉默。 結(jié)論：在我們的研究中揭示了一個(gè)hESCs在早期培養(yǎng)過程經(jīng)常發(fā)生的表觀異常現(xiàn)象-DLK1-DIO3印記區(qū)的異常沉默,這種沉默不光發(fā)生在我們細(xì)胞庫中的細(xì)胞,國際上其他其他實(shí)驗(yàn)室的一些多能性細(xì)胞系包括hES和hiPS也經(jīng)常發(fā)生這種沉默,其沉默伴隨著調(diào)控區(qū)域的高度甲基化,DLK1-DIO3沉默在培養(yǎng)過程不可逆且會(huì)傳遞給分化的子代細(xì)胞。進(jìn)一步,我們的研究發(fā)現(xiàn)20%的氧是引起這種改變的主要原因,把胚胎干細(xì)胞維持在5%濃度下分離、培養(yǎng)可以阻止這種改變的發(fā)生。我們的研究強(qiáng)調(diào)從最初始期開始培養(yǎng)條件對(duì)hESCs表觀穩(wěn)定性就有重要作用。 第三章追溯人胚胎干細(xì)胞分離和早期培養(yǎng)過程x染色體失活(XCI)動(dòng)態(tài)變化 目的：X染色體失活(XCI)是女性細(xì)胞為了維持X連鎖基因劑量補(bǔ)償所必需的,有一些研究報(bào)道了長期培養(yǎng)的女性胚胎干細(xì)胞系中存在多種XCI狀態(tài)。同時(shí),對(duì)于早期胚胎中的XCI狀態(tài)仍存在爭議。XIST是XCI啟動(dòng)和維持的關(guān)鍵基因,我們的目的一方面在于評(píng)估在培養(yǎng)早期階段XCI的變化和其對(duì)hESCs的影響以及分離過程X染色體失活狀態(tài),另一方面我們探討了氧濃度對(duì)XCI狀態(tài)的影響。 材料和方法：1,采用XIST基因Real-time PCR檢測(cè)結(jié)合H3K27me3免疫細(xì)胞化學(xué)判斷X染色體失活標(biāo)記在hESCs和其子代細(xì)胞中的表達(dá)情況；2,從X染色體轉(zhuǎn)錄活性和遲復(fù)制狀態(tài)判斷整條X染色體的活性；3,通過芯片結(jié)果比較兩個(gè)階段X染色體連鎖基因的表達(dá),評(píng)判X連鎖基因表達(dá)變化;4,通過直接測(cè)序的方法：X連鎖基因的表達(dá)情況為單等位表達(dá)還是雙等位表達(dá)來評(píng)估X染色體失活模式；5,通過在生理氧條件下重新分離、培養(yǎng)hESCs,評(píng)估氧濃度為XCI狀態(tài)的影響；6,通過XCI標(biāo)記H3K27me3點(diǎn)狀聚集和多能性標(biāo)記OCT4免疫細(xì)胞化學(xué)共染評(píng)羊hESCs分離過程X染色體失活的狀態(tài)。 結(jié)果：1,在培養(yǎng)的初始期階段,女性hESCs表達(dá)失活標(biāo)記XIST和H3K27me3的點(diǎn)狀聚集,在早期培養(yǎng)過程,XIST逐漸下調(diào),H3K27me3點(diǎn)狀聚集也逐步消失,至P20代以后,標(biāo)記幾乎完全丟失,這些標(biāo)記的表達(dá)方式會(huì)傳遞給分化的子代細(xì)胞。2,從整條X染色體的轉(zhuǎn)錄活性來看,初始期和早期hESCs都擁有一條X染色體無轉(zhuǎn)錄活性,處于遲復(fù)制狀態(tài)。3,從X染色體連鎖基因的轉(zhuǎn)錄水平來看,在這個(gè)標(biāo)記丟失的過程,約4%的X連鎖基因出現(xiàn)了1.5-2倍上調(diào)。4,從失活模式來看,初始期hESCs擁有一條隨機(jī)失活的X染色體,而隨著培養(yǎng)的進(jìn)行,早期hESCs中的失活模式轉(zhuǎn)變成了完全的偏斜失活模式。5,大部分生理氧條件分離、培養(yǎng)的女性hESCs在早期培養(yǎng)階段能維持正常的XCI狀態(tài)。6,在hESCs分離過程,在囊胚階段,女性樣本有一條失活的X染色體,而在分離過程,首先會(huì)出現(xiàn)X染色體的重新活化(約為受精后第8天),隨后又很快啟動(dòng)一條X染色體的失活(受精后第10天)。 結(jié)論：在目前的分離、培養(yǎng)體系,女性hESCs在早期培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)X染色體失活的動(dòng)態(tài)變化,即從擁有一條隨機(jī)失活的X染色體到一條偏斜失活且部分基因活化的X染色體,可知目前常規(guī)應(yīng)用的大氣氧培養(yǎng)條件有待進(jìn)一步改進(jìn),而生理氧培養(yǎng)有利于女性hESCs維持正常的XCI狀態(tài),；人類早期胚胎擁有一條失活的X染色體,在分離過程,會(huì)瞬時(shí)的出現(xiàn)兩條活化的階段,隨后啟動(dòng)XCI,類似小鼠早期發(fā)育過程中的XCI變化。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R321
【圖文】：

養(yǎng)兩個(gè)階段間改變的CNV和穩(wěn)定CNV數(shù)目統(tǒng)計(jì)，橫坐標(biāo)代表細(xì)胞系名稱，縱坐標(biāo)代表對(duì)應(yīng)CNV數(shù)目。譜芯片結(jié)果SCs標(biāo)本的質(zhì)控結(jié)果檢測(cè)要求多能性表面標(biāo)記SSEA4陽性細(xì)胞百分比大于95%才進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)，以圖為例，見圖1.3。^Specirr^ ^^^Specimen 002-45■ ■

( 1 ■ stable CNV丨丨liiil^ cp 4" 、今,^ ^ / /cell line圖1.2培養(yǎng)兩個(gè)階段間改變的CNV和穩(wěn)定CNV數(shù)目統(tǒng)計(jì)，橫坐標(biāo)代表細(xì)胞系名稱，縱坐標(biāo)代表對(duì)應(yīng)CNV數(shù)目。3.2表達(dá)譜芯片結(jié)果3.2.1 hESCs標(biāo)本的質(zhì)控結(jié)果流式檢測(cè)要求多能性表面標(biāo)記SSEA4陽性細(xì)胞百分比大于95%才進(jìn)行后續(xù)的芯片實(shí)驗(yàn)，以圖為例，見圖1.3。

傳背景聚在一起，而非細(xì)胞系代數(shù)，也就是說主要是同一細(xì)胞系不同代數(shù)聚在一起，早晚期之間的差異小于遺傳背景引起的差異，圖1.5。3.2.4.2同一細(xì)胞系不同代數(shù)樣本間的差異基因分析我們把相對(duì)早期的樣本（細(xì)胞系代數(shù)在P4-P9之間的樣本定義為ihESCs),把相對(duì)晚期的樣本（細(xì)胞系代數(shù)在P20-P30之間的樣本定義為ehESCs)。我們采用 SAM( Significance Analysis of Microarrays)軟件對(duì)同一■樣本 ihESC 是和 ehESCs之間進(jìn)行差異表達(dá)基因的分析，采用two class unpaired方法分析，并依據(jù)q-value(%)g%同時(shí)Fold Change>2或少5作為挑選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)。Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片共包含38500個(gè)基因的探針，我們對(duì)12個(gè)細(xì)胞系的差異表達(dá)基因進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示整個(gè)轉(zhuǎn)錄組中平均有0.10% ± 0.09%個(gè)有2倍以上的差異表達(dá)(12~136 out of 38500 genes)，并依據(jù)表達(dá)差異在2倍到4倍之間以及表達(dá)差異在4倍以上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見圖1.6，對(duì)同一細(xì)胞系早晚期樣本進(jìn)行散點(diǎn)圖分析

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2798249