發(fā)布時(shí)間：2020-08-20 18:02

【摘要】：Toll樣受體（Toll-like receptor, TLR）是天然免疫中最重要的模式識別受體之一，它能夠識別并結(jié)合一系列具有相同病原相關(guān)分子模式（PAMPs）的病原體和內(nèi)源性的損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號，啟動機(jī)體的免疫應(yīng)答并激活炎癥反應(yīng)。Toll樣受體的識別范圍廣泛，既包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲等病原體，還包含腫瘤抗原以及自身衰老和壞死細(xì)胞釋放的分子。Toll樣受體不僅表達(dá)于免疫細(xì)胞，也表達(dá)于腫瘤細(xì)胞。因此，Toll樣受體與宿主的感染、炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生等多種疾病存在交互關(guān)聯(lián)。但是截至目前為止，Toll樣受體在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制仍然不是很清楚。 感染和腫瘤發(fā)生過程中常伴隨著Toll樣受體信號激活的細(xì)胞吞噬和自噬現(xiàn)象。目前，在嚴(yán)重感染和腫瘤的治療領(lǐng)域中，針對Toll樣受體的靶向治療引起了越來越多的關(guān)注。但是Toll樣受體信號誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和病原體吞噬的分子機(jī)制仍然不清楚，介導(dǎo)Toll樣受體信號通路的細(xì)胞自噬相關(guān)因子以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍亟待深入探討。MAP1S是近年來新發(fā)現(xiàn)的自噬相關(guān)因子，在各種組織中廣泛表達(dá)，并且對細(xì)胞自噬的發(fā)生和發(fā)展具有促進(jìn)作用。截至目前，關(guān)于MAP1S介導(dǎo)Toll樣受體信號通路調(diào)控及其機(jī)制的研究仍未見報(bào)道。本研究以MAP1S為研究對象，從Toll樣受體信號促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能和Toll樣受體信號通過介導(dǎo)自噬抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖與遷移兩個(gè)層面，分析了Toll樣受體信號促進(jìn)細(xì)胞吞噬和自噬的分子機(jī)制，并探討了MAP1S在Toll樣受體信號串聯(lián)細(xì)胞吞噬和自噬功能中的作用。 細(xì)胞吞噬和自噬的過程中Toll樣受體處于激活狀態(tài)，并引發(fā)炎癥反應(yīng)，提示三者之間存在著必然的聯(lián)系。本研究以MAP1S基因敲除鼠為研究模型，利用不同的Toll樣受體激活劑刺激小鼠原代巨噬細(xì)胞，比較了野生型和MAP1S缺失的巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的差異，發(fā)現(xiàn)MAP1S的缺失顯著地下調(diào)了TLR2配體LTA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-6的含量。在檢測TLR2信號調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄激活因子活性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)MAP1S的缺失抑制了TLR2信號激活的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和轉(zhuǎn)錄激活因子p38的活性。在野生型巨噬細(xì)胞中，MAP1S的表達(dá)響應(yīng)TLR2信號而顯著性上調(diào)，并且表現(xiàn)出對LTA誘導(dǎo)的時(shí)間依賴性。此外，表達(dá)上調(diào)的MAP1S通過激活細(xì)胞自噬，反饋抑制Toll樣受體信號持續(xù)活化所致的炎癥反應(yīng)。以上結(jié)果提示，MAP1S對巨噬細(xì)胞TLR2信號具有雙向調(diào)控作用，具體地說，MAP1S參與早期TLR2信號誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)，而反饋性抑制晚期TLR2信號持續(xù)激活所致的過強(qiáng)炎癥反應(yīng)。研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，MAP1S的缺失降低了巨噬細(xì)胞部分TLRs的基礎(chǔ)表達(dá)，從而影響了巨噬細(xì)胞的細(xì)菌吞噬功能，而且巨噬細(xì)胞的細(xì)菌殺傷能力同樣由于MAP1S的缺失而顯著下調(diào)。 在腫瘤細(xì)胞的Toll樣受體信號與細(xì)胞自噬發(fā)生的關(guān)系研究中，鑒于前期研究結(jié)果提示，TLR5配體flagellin對乳腺癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，因此，我們首先利用全細(xì)胞MALDI-TOF質(zhì)譜確認(rèn)了flagellin對乳腺癌細(xì)胞MCF-7活性的抑制作用，并證實(shí)了自噬相關(guān)因子MAP1S在多種乳腺癌細(xì)胞中的普遍表達(dá)。MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，MAP1S沉默的MCF-7細(xì)胞不響應(yīng)flagellin的抑制作用。經(jīng)flagellin處理的MCF-7細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯現(xiàn)象，細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)顯著下調(diào)，而周期依賴型激酶抑制因子p27的表達(dá)明顯上調(diào)，但MAP1S沉默的MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期沒有發(fā)生任何改變。由此證實(shí)，MAP1S可通過TLR信號通路調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖，當(dāng)TLR受到特異性配體激活后，可通過MAP1S介導(dǎo)細(xì)胞增殖的調(diào)控信號通路。 考慮到MAP1S具有調(diào)控細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)動態(tài)穩(wěn)定的功能，本研究采用侵襲小室和細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)，檢測了MAP1S是否影響經(jīng)flagellin處理的MCF-7細(xì)胞的侵襲和遷移能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，flagellin能夠極大程度地抑制MCF-7細(xì)胞的侵襲和遷移，但在MAP1S沉默的MCF-7細(xì)胞中，flagellin的抑癌作用受到了限制，提示MAP1S在flagellin抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的過程中起著關(guān)鍵作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，MAP1S在flagellin誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子IL-8和TNF-α的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。MAP1S也會響應(yīng)TLR5信號而表達(dá)上調(diào)，表達(dá)上調(diào)的MAP1S通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬反應(yīng)，反饋性地抑制腫瘤細(xì)胞中TLR5信號持續(xù)激活的炎癥反應(yīng)。 為了探討MAP1S在巨噬細(xì)胞Toll樣受體信號促進(jìn)細(xì)胞吞噬和在乳腺癌細(xì)胞Toll樣受體信號抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移過程中的分子機(jī)制，本研究利用免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)，分別對巨噬細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和正常的人胚腎HEK293T細(xì)胞中Toll樣受體信號誘導(dǎo)自噬標(biāo)志分子LC3的LC3II/I蛋白比例以及LC3聚集體形成（自噬或吞噬功能增加的標(biāo)志）進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，只有MAP1S表達(dá)響應(yīng)的Toll樣受體信號才能誘導(dǎo)細(xì)胞中的LC3聚集體的形成和LC3II/I比例的增加，提示在MCF-7細(xì)胞中flagellin/TLR5信號誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的自噬發(fā)生，在巨噬細(xì)胞中LTA或細(xì)菌/TLR2信號促進(jìn)了細(xì)胞的吞噬功能。 為獲得MAP1S介導(dǎo)TLR信號通路活化的調(diào)控位點(diǎn)，本研究進(jìn)一步分析了MAP1S與Toll樣受體接頭蛋白MyD88的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MAP1S與MyD88具有相互作用，并且MAP1S可以通過響應(yīng)Toll樣受體信號將MyD88轉(zhuǎn)運(yùn)至LC3II結(jié)合的自噬體或吞噬體，促進(jìn)自噬體/吞噬體的成熟。而響應(yīng)性上調(diào)表達(dá)的MAP1S可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，選擇性地降解MyD88，反饋抑制Toll樣受體信號的持續(xù)活化。 綜上所述，本文通過研究自噬相關(guān)因子MAP1S對巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞Toll樣受體信號的調(diào)控，證實(shí)了MAP1S通過介導(dǎo)Toll樣受體信號促進(jìn)細(xì)胞吞噬和自噬的功能，這一發(fā)現(xiàn)是Toll樣受體、細(xì)胞自噬與吞噬作用相關(guān)性的最新證據(jù)，也為研究Toll樣受體信號促進(jìn)細(xì)胞自噬和吞噬作用的深層機(jī)制提供了一條新的線索。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392.12
【圖文】：

圖 1-1 細(xì)胞吞噬過程[92]Fig. 1-1 Phases of phagocytosis噬細(xì)胞的受體細(xì)胞的受體通過結(jié)合被吞噬粒子表面的配體啟動吞噬的最初gulfment）。很多受體參與吞噬過程，F(xiàn)cγ受體（FcγRs）在吞噬比較清晰，F(xiàn)cγ受體通過自身磷酸化或由Src家族蛋白激酶磷酸胞內(nèi)信號[7]。脂筏（lipid raft）起著偶聯(lián)蛋白激酶和受體的作用相關(guān)的細(xì)胞吞噬中并不起主要作用[94]�？乖岢始�(xì)胞主要的吞夠識別假絲酵母細(xì)胞表面表達(dá)的β-葡聚糖，但是假絲酵母的致體能夠轉(zhuǎn)換為絲狀形態(tài)逃避Dectin-1的識別和吞噬細(xì)胞的吞噬[9受體如scavenger receptors (SR)在細(xì)胞吞噬中的作用尚不明確，SR敲除鼠來源的樹突狀細(xì)胞對大腸桿菌的內(nèi)吞能力有所下降[97細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬常伴隨著由 TLR 信號激活的炎癥反應(yīng)，這一噬和 TLR 有著功能上的相互聯(lián)系。Blander 和 Medzhitov[5, 6]發(fā)

膜直至形成完整的自噬體（autophagosome）。自噬體和溶酶體（lysosome）合，發(fā)展成熟成為自噬溶酶體（autolysosome），內(nèi)涵物在自噬溶酶體中降解圖 1-2）。已有研究證明，自噬體形成初期的膜來源于線粒體、高爾基復(fù)合體和內(nèi)質(zhì)[121, 122]，但是自噬泡的膜延長過程中的膜來源及機(jī)制尚不清晰。介導(dǎo)膜泡運(yùn)和融合作用的 SNAREs 或小 GTPase在自噬體形成過程中沒有直接發(fā)揮作用。管定位于高爾基的 GTPase Rab33B 與 Atg16L 有直接相互作用，但是其相互用在自噬中的作用仍不清晰[123]。近期研究表明，Atg9 的自身多聚化能促進(jìn)的融合。Atg9 是唯一被發(fā)現(xiàn)與自噬體形成有關(guān)的完整的膜蛋白。在酵母中，tg9 定位于自噬泡組裝位點(diǎn)（PAS）及其周圍結(jié)構(gòu)[124]。Atg11，Atg23 和 Atg27于 Atg9 轉(zhuǎn)運(yùn)到 PAS 的過程至關(guān)重要[125-128]。因此，Atg9 可能作為運(yùn)載膜的體通過動態(tài)的自身相互作用在自噬泡延長過程中起作用。當(dāng)自噬開始時(shí)，哺動物 Atg9 與 LC3 結(jié)合，實(shí)現(xiàn)從反式高爾基網(wǎng)絡(luò)（TGN）到后期內(nèi)涵體endosome）的轉(zhuǎn)運(yùn)。Atg9 從反式高爾基網(wǎng)絡(luò)（TGN）到后期內(nèi)涵體的再分配程決定于 ULK1 和 Atg13[129, 130]。

第 1 章 緒 論和其他泛素化的載體，運(yùn)輸至自噬體完成自噬降解[137, 138]。哺乳動物蛋白 p62和酵母蛋白 Atg19的 C 端模序在結(jié)構(gòu)和功能上的相似性產(chǎn)生了一個(gè)假說，即p62是 Atg19 在高等真核生物中的同源類似物，它們的作用是作為細(xì)胞自噬中的受體，選擇性招募泛素化蛋白或泛素化細(xì)胞器至自噬體[139]。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Juliana Garcia de Oliveira;Ana Elizabete Silva;;Polymorphisms of the TLR2 and TLR4 genes are associated with risk of gastric cancer in a Brazilian population[J];World Journal of Gastroenterology;2012年11期

本文編號：2798275