【摘要】：目的:沙門菌作為兼性胞內菌,感染后在巨噬細胞內的命運取決于細胞殺傷能力和細菌毒力相互作用的結果。中性粒細胞是數(shù)量最多的白細胞,具有趨化、吞噬和殺傷作用。在感染早期中性粒細胞迅速到達感染部位發(fā)揮較巨噬細胞更強的殺傷清除細菌功能,并作為“清道夫”能有效清除凋亡的巨噬細胞,在機體防御沙門菌感染中亦發(fā)揮重要的作用。自噬是細胞內自身功能受損的大分子物質、細胞器及入侵的病原生物等成分被溶酶體降解的過程。細胞Ⅰ型干擾素反應是機體抗病毒的第一道防線,其在抗菌固有免疫反應中作用因細菌不同而異,能夠促進細胞因子和趨化因子的分泌影響機體炎癥反應。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn),沙門菌質粒毒力基因spv能抑制自噬并影響中性粒細胞的功能。為進一步探討spv對細菌逃逸固有免疫反應的影響及機制,本研究第一部分用攜帶spv基因的鼠傷寒沙門菌野生株STM-WT和spv基因缺陷株STM-Δspv感染巨噬細胞模型,探討spv對細胞自噬和Ⅰ型干擾素反應的影響。第二部分以僅有固有免疫系統(tǒng)的斑馬魚幼魚作為模式動物,進一步探討spv抑制自噬和細胞Ⅰ型干擾素反應及其對中性粒細胞趨化功能的影響,為闡明spv的致病機制及其對機體固有免疫功能的影響提供理論和實驗依據(jù)。方法:一、spv對巨噬細胞自噬和I型干擾素反應的影響1.spv對巨噬細胞自噬的影響STM-WT和STM-Δspv以感染復數(shù)(mutiplicity of infection,MOI)10:1感染小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7。于感染后1 h、2 h、4 h和6 h收集細胞,Western Blot檢測自噬相關蛋白LC3和p62的表達水平,比較兩組之間的差異并確定激活自噬的時相。2.spv對巨噬細胞I型干擾素反應的影響用STM-WT和STM-Δspv分別與RAW264.7細胞共培養(yǎng),于感染后2 h、4 h和6 h收集細胞,實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-q PCR)檢測I型干擾素反應相關基因TRIF、TRAF3和IFN-β的m RNA轉錄水平。3.spv對巨噬細胞自噬和I型干擾素反應的影響用5 n M自噬激動劑Torin 1預處理RAW264.7細胞3 h,STM-WT和STM-Δspv分別與細胞共培養(yǎng)。Western Blot檢測感染后2 h細胞自噬相關蛋白LC3的表達水平;RT-q PCR檢測感染后4 h TRIF、TRAF3和IFN-β的m RNA轉錄水平。二、spv對斑馬魚幼魚自噬和Ⅰ型干擾素反應及中性粒細胞趨化的影響1.spv對斑馬魚幼魚自噬和Ⅰ型干擾素反應的影響109 CFU/ml STM-WT和STM-Δspv浸染受精后5 d(days post fertilization,dpf)的斑馬魚幼魚。收集感染后6 h、8 h和10 h幼魚,Western Blot檢測自噬相關蛋白LC3和p62的表達水平;RT-q PCR檢測斑馬魚I型干擾素反應相關基因IRF3、IRF7、和IFN-β的m RNA轉錄水平。2.spv對中性粒細胞趨化功能的影響用STM-WT和STM-Δspv浸染斑馬魚幼魚。感染后6 h、8 h和10 h,RT-q PCR檢測細胞因子IFN-γ、趨化因子CXCL8-L1和CXCL8-L2的m RNA轉錄水平。用紅色熒光蛋白(red fluorescence protein,RFP)標記的STM-WT和STM-Δspv感染綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)標記中性粒細胞的轉基因斑馬魚Tg(lyz:GFP),激光共聚焦顯微鏡觀察細菌播散情況及與中性粒細胞的相互作用。3.spv對自噬、I型干擾素反應和中性粒細胞趨化功能的影響用0.4μmol Torin 1預處理斑馬魚幼魚48 h,STM-WT和STM-Δspv感染幼魚。感染后8 h收集斑馬魚,Western Blot檢測自噬相關蛋白LC3的表達水平;RT-q PCR檢測IRF3、IRF7、IFN-β、IFN-γ、CXCL8-L1和CXCL8-L2的m RNA轉錄水平。結果:一.spv對巨噬細胞自噬和I型干擾素反應的影響1.spv對巨噬細胞自噬的影響Western Blot結果顯示,感染后1 h和2 h STM-WT組LC3-Ⅱ水平低于STM-Δspv組(P0.05);感染后4 h和6 h組間LC3-Ⅱ水平均無明顯差異(P0.05)。感染后1 h和2 h兩組之間p62水平無明顯差異(P0.05);感染后4 h STM-WT組p62水平明顯高于STM-Δspv組(P0.05);感染后6 h兩感染組p62水平均高于對照組(P0.05),組間無明顯差異(P0.05)。2.spv對巨噬細胞I型干擾素反應的影響RT-q PCR結果顯示,感染后2 h,4 h和6 h STM-WT感染組基因TRIF,TRAF3和IFN-β的m RNA轉錄水平均明顯低于STM-Δspv感染組(P0.05)。3.spv對巨噬細胞自噬和I型干擾素反應的影響Western Blot檢測自噬相關蛋白LC3結果顯示,感染后2 h STM-WT組LC3-Ⅱ表達水平低于STM-Δspv組;用Torin 1預處理后,STM-WT組細胞LC3-Ⅱ表達水平明顯增高(P0.05),組間無明顯差異(P0.05)。RT-q PCR結果顯示,感染后4h STM-WT組TRIF、TRAF3和IFN-β的m RNA轉錄水平低于STM-Δspv組(P0.05);用Torin 1預處理后STM-WT組TRIF、TRAF3和IFN-β轉錄水平均升高(P0.05)且組間無顯著差異(P0.05)。二.spv對斑馬魚幼魚自噬和Ⅰ型干擾素反應及中性粒細胞趨化的影響1.spv對斑馬魚幼魚自噬和Ⅰ型干擾素反應的影響檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ和p62結果顯示,在感染后6 h和8 h STM-Δspv組LC3-Ⅱ表達水平高于STM-WT組(P0.05);感染后8 h p62水平明顯低于STM-WT組(P0.05);感染后10 h兩組LC3-Ⅱ和p62表達水平無明顯差異。檢測斑馬魚幼魚Ⅰ型干擾素反應相關基因IRF3、IRF7和IFN 1的m RNA轉錄水平,結果顯示在感染后6 h和8 h STM-Δspv組IRF3、IRF7和IFN 1基因轉錄水平均明顯高于STM-WT組(P0.05),感染后10 h兩組之間無明顯差異(P0.05)。2.spv對中性粒細胞趨化功能的影響RT-q PCR檢測IFN-γ、CXCL8-L1和CXCL8-L2基因的m RNA轉錄水平結果顯示,與STM-WT組相比,在感染后6 h和8 h STM-Δspv組IFN-γ、CXCL8-L1和CXCL8-L2轉錄水平均明顯升高(P0.05)。激光共聚焦顯微鏡觀察到RFP-STM-WT組細菌播散明顯多于RFP-STM-Δspv組,且在感染后8 h和10 h明顯觀察到中性粒細胞聚集減少。4.spv對自噬、Ⅰ型干擾素反應和中性粒細胞趨化的影響Western Blot檢測LC3結果顯示,感染后8 h STM-WT組LC3-Ⅱ表達水平低于STM-Δspv組;用Torin 1預處理后,STM-WT組LC3-Ⅱ表達水平明顯增高,組間無明顯差異(P0.05)。RT-q PCR結果顯示,在感染后8 h STM-WT組IRF3、IRF7、IFN 1、IFN-γ、CXCL8-L1和CXCL8-L2的m RNA轉錄水平均低于STM-Δspv組(P0.05)。用Torin 1預處理后,兩組IRF3和IRF7水平均顯著增高,組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);STM-WT組IFN 1、IFN-γ、CXCL8-L1和CXCL8-L2轉錄水平均升高,組間無顯著差異(P0.05)。結論:1.spv通過抑制自噬抑制巨噬細胞Ⅰ型干擾素反應。2.spv在斑馬魚幼魚感染模型中通過抑制自噬抑制Ⅰ型干擾素反應。3.spv通過抑制Ⅰ型干擾素反應影響中性粒細胞趨化功能。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392
【圖文】：

附圖 1. 模式識別受體識別沙門菌激活宿主細胞信號通路影響炎癥反應干擾素（interferons，IFNs）是人類第一個被發(fā)現(xiàn)的一種抗病毒細胞因子。根據(jù)其活性、結構以及相應的受體類型，可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型干擾素包括 IFN-α、β、κ、ω、τ 和 ε，其中對 IFN-α 和 IFN-β 研究較多。Ⅱ型干擾素僅有細

沙門菌質粒毒力基因 spv 通過自噬影響巨噬細胞Ⅰ型干擾素反應和中性粒細胞趨化的研究 第一部分2. 結 果2.1 spv 對巨噬細胞自噬的影響收集感染后 1 h、2 h、4 h、6 h及對照組細胞，Western Blot 檢測自噬相關蛋白 LC3 和 p62 表達水平。實驗結果顯示，感染后 1 h和 2 h STM-WT 組 LC3-Ⅱ水平明顯低于 STM-Δspv 組；感染后 4 h和 6 h兩感染組細胞 LC3-Ⅱ表達水平無明顯差異。感染后 1 h和 2 h 兩感染組 p62 表達水平無明顯差異；感染后 4 hSTM-WT組 p62 表達水平明顯高于 STM-Δspv 感染組；感染后 6 h p62 表達水平兩組之間無明顯差異但明顯高于對照組（圖 1-1）。

14圖 1-2 不同感染時間點 spv 對 I 型干擾素反應的影響1-2 The effect of spv locus on Type I IFN response at different infect(*P<0.05)spv 對巨噬細胞自噬和 I 型干擾素反應的影響1 Torin 1 處理后 Western Blot 檢測自噬相關蛋白的表達水平激動劑 Torin 1 預處理細胞 3 h后，細菌與細胞共作用 2 h。收

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本文編號：2798004