【摘要】：目的:沙門菌作為兼性胞內(nèi)菌,感染后在巨噬細(xì)胞內(nèi)的命運(yùn)取決于細(xì)胞殺傷能力和細(xì)菌毒力相互作用的結(jié)果。中性粒細(xì)胞是數(shù)量最多的白細(xì)胞,具有趨化、吞噬和殺傷作用。在感染早期中性粒細(xì)胞迅速到達(dá)感染部位發(fā)揮較巨噬細(xì)胞更強(qiáng)的殺傷清除細(xì)菌功能,并作為“清道夫”能有效清除凋亡的巨噬細(xì)胞,在機(jī)體防御沙門菌感染中亦發(fā)揮重要的作用。自噬是細(xì)胞內(nèi)自身功能受損的大分子物質(zhì)、細(xì)胞器及入侵的病原生物等成分被溶酶體降解的過程。細(xì)胞Ⅰ型干擾素反應(yīng)是機(jī)體抗病毒的第一道防線,其在抗菌固有免疫反應(yīng)中作用因細(xì)菌不同而異,能夠促進(jìn)細(xì)胞因子和趨化因子的分泌影響機(jī)體炎癥反應(yīng)。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn),沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv能抑制自噬并影響中性粒細(xì)胞的功能。為進(jìn)一步探討spv對(duì)細(xì)菌逃逸固有免疫反應(yīng)的影響及機(jī)制,本研究第一部分用攜帶spv基因的鼠傷寒沙門菌野生株STM-WT和spv基因缺陷株STM-Δspv感染巨噬細(xì)胞模型,探討spv對(duì)細(xì)胞自噬和Ⅰ型干擾素反應(yīng)的影響。第二部分以僅有固有免疫系統(tǒng)的斑馬魚幼魚作為模式動(dòng)物,進(jìn)一步探討spv抑制自噬和細(xì)胞Ⅰ型干擾素反應(yīng)及其對(duì)中性粒細(xì)胞趨化功能的影響,為闡明spv的致病機(jī)制及其對(duì)機(jī)體固有免疫功能的影響提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:一、spv對(duì)巨噬細(xì)胞自噬和I型干擾素反應(yīng)的影響1.spv對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的影響STM-WT和STM-Δspv以感染復(fù)數(shù)(mutiplicity of infection,MOI)10:1感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7。于感染后1 h、2 h、4 h和6 h收集細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的表達(dá)水平,比較兩組之間的差異并確定激活自噬的時(shí)相。2.spv對(duì)巨噬細(xì)胞I型干擾素反應(yīng)的影響用STM-WT和STM-Δspv分別與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng),于感染后2 h、4 h和6 h收集細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-q PCR)檢測(cè)I型干擾素反應(yīng)相關(guān)基因TRIF、TRAF3和IFN-β的m RNA轉(zhuǎn)錄水平。3.spv對(duì)巨噬細(xì)胞自噬和I型干擾素反應(yīng)的影響用5 n M自噬激動(dòng)劑Torin 1預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞3 h,STM-WT和STM-Δspv分別與細(xì)胞共培養(yǎng)。Western Blot檢測(cè)感染后2 h細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)水平;RT-q PCR檢測(cè)感染后4 h TRIF、TRAF3和IFN-β的m RNA轉(zhuǎn)錄水平。二、spv對(duì)斑馬魚幼魚自噬和Ⅰ型干擾素反應(yīng)及中性粒細(xì)胞趨化的影響1.spv對(duì)斑馬魚幼魚自噬和Ⅰ型干擾素反應(yīng)的影響109 CFU/ml STM-WT和STM-Δspv浸染受精后5 d(days post fertilization,dpf)的斑馬魚幼魚。收集感染后6 h、8 h和10 h幼魚,Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的表達(dá)水平;RT-q PCR檢測(cè)斑馬魚I型干擾素反應(yīng)相關(guān)基因IRF3、IRF7、和IFN-β的m RNA轉(zhuǎn)錄水平。2.spv對(duì)中性粒細(xì)胞趨化功能的影響用STM-WT和STM-Δspv浸染斑馬魚幼魚。感染后6 h、8 h和10 h,RT-q PCR檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、趨化因子CXCL8-L1和CXCL8-L2的m RNA轉(zhuǎn)錄水平。用紅色熒光蛋白(red fluorescence protein,RFP)標(biāo)記的STM-WT和STM-Δspv感染綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)標(biāo)記中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(lyz:GFP),激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)菌播散情況及與中性粒細(xì)胞的相互作用。3.spv對(duì)自噬、I型干擾素反應(yīng)和中性粒細(xì)胞趨化功能的影響用0.4μmol Torin 1預(yù)處理斑馬魚幼魚48 h,STM-WT和STM-Δspv感染幼魚。感染后8 h收集斑馬魚,Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)水平;RT-q PCR檢測(cè)IRF3、IRF7、IFN-β、IFN-γ、CXCL8-L1和CXCL8-L2的m RNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果:一.spv對(duì)巨噬細(xì)胞自噬和I型干擾素反應(yīng)的影響1.spv對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的影響Western Blot結(jié)果顯示,感染后1 h和2 h STM-WT組LC3-Ⅱ水平低于STM-Δspv組(P0.05);感染后4 h和6 h組間LC3-Ⅱ水平均無明顯差異(P0.05)。感染后1 h和2 h兩組之間p62水平無明顯差異(P0.05);感染后4 h STM-WT組p62水平明顯高于STM-Δspv組(P0.05);感染后6 h兩感染組p62水平均高于對(duì)照組(P0.05),組間無明顯差異(P0.05)。2.spv對(duì)巨噬細(xì)胞I型干擾素反應(yīng)的影響RT-q PCR結(jié)果顯示,感染后2 h,4 h和6 h STM-WT感染組基因TRIF,TRAF3和IFN-β的m RNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯低于STM-Δspv感染組(P0.05)。3.spv對(duì)巨噬細(xì)胞自噬和I型干擾素反應(yīng)的影響Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3結(jié)果顯示,感染后2 h STM-WT組LC3-Ⅱ表達(dá)水平低于STM-Δspv組;用Torin 1預(yù)處理后,STM-WT組細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)水平明顯增高(P0.05),組間無明顯差異(P0.05)。RT-q PCR結(jié)果顯示,感染后4h STM-WT組TRIF、TRAF3和IFN-β的m RNA轉(zhuǎn)錄水平低于STM-Δspv組(P0.05);用Torin 1預(yù)處理后STM-WT組TRIF、TRAF3和IFN-β轉(zhuǎn)錄水平均升高(P0.05)且組間無顯著差異(P0.05)。二.spv對(duì)斑馬魚幼魚自噬和Ⅰ型干擾素反應(yīng)及中性粒細(xì)胞趨化的影響1.spv對(duì)斑馬魚幼魚自噬和Ⅰ型干擾素反應(yīng)的影響檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和p62結(jié)果顯示,在感染后6 h和8 h STM-Δspv組LC3-Ⅱ表達(dá)水平高于STM-WT組(P0.05);感染后8 h p62水平明顯低于STM-WT組(P0.05);感染后10 h兩組LC3-Ⅱ和p62表達(dá)水平無明顯差異。檢測(cè)斑馬魚幼魚Ⅰ型干擾素反應(yīng)相關(guān)基因IRF3、IRF7和IFN 1的m RNA轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示在感染后6 h和8 h STM-Δspv組IRF3、IRF7和IFN 1基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯高于STM-WT組(P0.05),感染后10 h兩組之間無明顯差異(P0.05)。2.spv對(duì)中性粒細(xì)胞趨化功能的影響RT-q PCR檢測(cè)IFN-γ、CXCL8-L1和CXCL8-L2基因的m RNA轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果顯示,與STM-WT組相比,在感染后6 h和8 h STM-Δspv組IFN-γ、CXCL8-L1和CXCL8-L2轉(zhuǎn)錄水平均明顯升高(P0.05)。激光共聚焦顯微鏡觀察到RFP-STM-WT組細(xì)菌播散明顯多于RFP-STM-Δspv組,且在感染后8 h和10 h明顯觀察到中性粒細(xì)胞聚集減少。4.spv對(duì)自噬、Ⅰ型干擾素反應(yīng)和中性粒細(xì)胞趨化的影響Western Blot檢測(cè)LC3結(jié)果顯示,感染后8 h STM-WT組LC3-Ⅱ表達(dá)水平低于STM-Δspv組;用Torin 1預(yù)處理后,STM-WT組LC3-Ⅱ表達(dá)水平明顯增高,組間無明顯差異(P0.05)。RT-q PCR結(jié)果顯示,在感染后8 h STM-WT組IRF3、IRF7、IFN 1、IFN-γ、CXCL8-L1和CXCL8-L2的m RNA轉(zhuǎn)錄水平均低于STM-Δspv組(P0.05)。用Torin 1預(yù)處理后,兩組IRF3和IRF7水平均顯著增高,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);STM-WT組IFN 1、IFN-γ、CXCL8-L1和CXCL8-L2轉(zhuǎn)錄水平均升高,組間無顯著差異(P0.05)。結(jié)論:1.spv通過抑制自噬抑制巨噬細(xì)胞Ⅰ型干擾素反應(yīng)。2.spv在斑馬魚幼魚感染模型中通過抑制自噬抑制Ⅰ型干擾素反應(yīng)。3.spv通過抑制Ⅰ型干擾素反應(yīng)影響中性粒細(xì)胞趨化功能。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

附圖 1. 模式識(shí)別受體識(shí)別沙門菌激活宿主細(xì)胞信號(hào)通路影響炎癥反應(yīng)干擾素（interferons，IFNs）是人類第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的一種抗病毒細(xì)胞因子。根據(jù)其活性、結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)的受體類型，可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型干擾素包括 IFN-α、β、κ、ω、τ 和 ε，其中對(duì) IFN-α 和 IFN-β 研究較多。Ⅱ型干擾素僅有細(xì)

沙門菌質(zhì)粒毒力基因 spv 通過自噬影響巨噬細(xì)胞Ⅰ型干擾素反應(yīng)和中性粒細(xì)胞趨化的研究 第一部分2. 結(jié) 果2.1 spv 對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的影響收集感染后 1 h、2 h、4 h、6 h及對(duì)照組細(xì)胞，Western Blot 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白 LC3 和 p62 表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染后 1 h和 2 h STM-WT 組 LC3-Ⅱ水平明顯低于 STM-Δspv 組；感染后 4 h和 6 h兩感染組細(xì)胞 LC3-Ⅱ表達(dá)水平無明顯差異。感染后 1 h和 2 h 兩感染組 p62 表達(dá)水平無明顯差異；感染后 4 hSTM-WT組 p62 表達(dá)水平明顯高于 STM-Δspv 感染組；感染后 6 h p62 表達(dá)水平兩組之間無明顯差異但明顯高于對(duì)照組（圖 1-1）。

14圖 1-2 不同感染時(shí)間點(diǎn) spv 對(duì) I 型干擾素反應(yīng)的影響1-2 The effect of spv locus on Type I IFN response at different infect(*P<0.05)spv 對(duì)巨噬細(xì)胞自噬和 I 型干擾素反應(yīng)的影響1 Torin 1 處理后 Western Blot 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平激動(dòng)劑 Torin 1 預(yù)處理細(xì)胞 3 h后，細(xì)菌與細(xì)胞共作用 2 h。收

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本文編號(hào)：2798004