【摘要】：糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids, GC)不僅有導致骨質(zhì)疏松的骨分解,還有促骨生成作用。然而目前尚不清楚什么因子介導GC的促骨生成作用。糖皮質(zhì)激素誘導亮氨酸拉鏈蛋白(glucocorticoid-induced leucine zipper, GILZ)是GC誘導的一種抗炎介導因子。在本研究中,我們通過構(gòu)建骨特異性GILZ過表達Tg鼠,證實GILZ具有促進在體骨生成的作用。 我們首先構(gòu)建GILZ-HA真核表達載體(Col3.6-GILZ-HA),其編碼基因由片段長度為3.6kb的I型膠原啟動子(Co13.6)驅(qū)動。我們委托生物技術(shù)公司將目的基因植入C57BL/6小鼠基因組。在獲得原代轉(zhuǎn)基因鼠(Tg)后,我們繁育了三個獨立的鼠系,并根據(jù)它們的基因拷貝數(shù)和目的基因在骨組織中的表達,篩選出最優(yōu)鼠系。該系Tg鼠骨組織GILZ表達明顯升高,與GC誘導的內(nèi)源性GILZ升高水平接近。Tg鼠在身長、體重、采食、行為、繁殖能力等方面與同窩對照鼠(WT,外源基因陰性)均無明顯差異。 Tg鼠系建立以后,我們首先采用骨密度分析儀對3月齡鼠進行分析。結(jié)果顯示,與WT相比,Tg骨密度(BMD)和骨含量(BMC)均出現(xiàn)明顯升高,其中雄性BMD和BMC分別顯著增加12%和24%(p0.05),雌性BMD和BMC分別顯著增加12%和16%(p0.05)。 顯微CT掃描圖像三維重建發(fā)現(xiàn),與同窩WT相比,3月齡Tg鼠股骨遠端骨體積(BV/TV)增加28%(p0.05)；骨小梁數(shù)量(Tb.N)顯著增加15%(p0.05)；骨小梁直徑(Tb.Th)顯著增加13%(p0.05)；骨小梁間隙(Tb.Sp)、連接系數(shù)(Conn. D)和結(jié)構(gòu)指數(shù)(SMI)無明顯差異(p0.05)。至6月齡,二者差異進一步加大,Tg鼠BV/TV較WT增加73%；Tb.N增加53%;Tb.Th增加15%；Tb.Sp減少41%；Conn. D增加150%；SMI減少22%,差異均具有顯著性(p0.05)。骨量增加既可能是骨生成增加的結(jié)果,也可能是骨重吸收減少的結(jié)果。為確定Tg鼠骨生成是否增加,我們采用了鈣綠素雙標實驗觀察3月齡股骨的骨生成變化。結(jié)果證實,Tg骨生成確實大幅度增加,其中：骨礦化率(mineral apposition rate, MAR)較WT增加2倍；礦化面積(MS/BS)增加26%；骨生成率(bone formation rate, BFR)增加2.5倍。骨脫鈣切片組織形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn),Tg骨小梁上附著的成骨細胞(Osteoblasts,Ob)顯著增多。與WT相比,Tg在骨小梁上Ob密度(N.Ob/B.Pm)增加93%(p0.05)；成骨細胞面積(Ob.S/BS)增加46.7%。此外我們還觀察到Tg骨髓腔中,脂肪細胞有一定程度的減少。為了證明Ob數(shù)量增加是骨髓干細胞成骨分化增強,成脂肪分化減弱的結(jié)果,我們進行了骨髓集落生成單位(colony formation unit, CFU)分析。新鮮骨髓稀釋成單細胞懸液,以極低密度接種。給予常規(guī)培養(yǎng)液,或成骨誘導培養(yǎng)液,或成脂肪誘導培養(yǎng)液處理,在固定時間點分別固定細胞,給予Giemsa染色,以分析成纖維細胞集落(CFU-F);或油紅染色,以分析成脂肪細胞集落(CFU-Ad),或孵育堿性磷酸酶(ALP)底物,以分析成骨細胞集落(CFU-Ob)。 CFU-F分析顯示Tg與WT無顯著差異,說明骨髓干細胞數(shù)量無明顯變化。而CFU-Ob顯示,Tg顯著高于WT；而CFU-Ad相反,Tg顯著低于WT。這說明Tg骨髓細胞中,骨分化潛能的細胞比例增多。與之相對應(yīng),脂肪分化潛能細胞減少。 為了在基因水平檢驗GILZ過表達對骨髓細胞的影響,我們采用實時定量Rt-PCR,分析體外培養(yǎng)原代骨髓細胞的轉(zhuǎn)錄因子水平變化,發(fā)現(xiàn)在Tg骨髓細胞中,兩種關(guān)鍵性成骨調(diào)控因子,Runx2和Osx的基礎(chǔ)mRNA水平較WT分別增加2.4倍和4.7倍(p0.05)；而成脂肪調(diào)控因子PPARγ2則顯著下降,為WT水平的67.5%(p0.05)。經(jīng)過6天的成骨培養(yǎng)液誘導,WT和Tg骨髓細胞的Runx2和Osx均上升。相比之下,WT上升幅度更大。Runx2的mRNA水平Tg僅為WT的1.2倍,差異不再顯著(p0.05),而Osx的mRNA水平Tg仍然高于顯著WT,是其2.7倍(p0.05)。PPARγ2的mRNA水平Tg與WT差距進一步加大,降至WT的1%。上述結(jié)果說明GILZ改變了骨髓細胞中調(diào)控因子的表達,增加成骨凋控因子,降低成脂肪調(diào)控因子,使更多細胞傾向于成骨,而非成脂肪分化。 PPARγ2是控制骨髓干細胞成脂肪分化的關(guān)鍵因子。PPARγ2的表達需要C/EBPs蛋白參與。為進一步明確GILZ與C/EBPs的相互作用。我們進行了一系列蛋白-蛋白、蛋白-DNA相互作用的研究。免疫共沉淀實驗和GST-pull down實驗均證實,發(fā)現(xiàn),HA-GILZ可以與Flag-C/EBP蛋白一起被anti-Flag抗體所共沉淀。GILZ可與C/EBP蛋白牢固結(jié)合。在凝膠遷移(EMSA)實驗發(fā)現(xiàn),GILZ并不影響GST-C/EBPP與DNA結(jié)合的活性。相反,GILZ可以與C/EBPP共同結(jié)合DNA,形成蛋白-蛋白-DNA復合物,使C/EBPP與DNA結(jié)合增強。在DNA-pull down進一步證實在細胞內(nèi),GILZ、C/EBPβ與DNA之間可以形成特異性的蛋白-蛋白-DNA復合物。GILZ可能與C/EBP形成異源二聚體,共同轉(zhuǎn)移至胞核并結(jié)合于結(jié)合位點。但GILZ-C/EBP二聚體不能激活下游PPARγ2勺表達,相反還使其表達受抑制。 結(jié)論：GILZ具有促骨生成作用。在體環(huán)境下,GILZ可使Ob數(shù)量增多,骨組織體積增大,骨結(jié)構(gòu)改善,骨質(zhì)量和礦物質(zhì)沉積增加。GILZ的促骨生成機制包括：抑制成脂肪調(diào)控因子PPARγ表達；增加成骨調(diào)控因子Runx2、Osx等表達；刺激MSCs的成骨分化,抑制成脂肪分化。GILZ可能是迄今為止第一種被發(fā)現(xiàn)的GC誘導的促骨生成介導因子。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R336
【圖文】：

Ir.L.Th測量示意

圖1.候選建系鼠基因拷貝檢測準DNA。無基因修飾背景的C57/B6鼠尾DNA中滲入不同拷貝的pCol3.6-GILZ-H的PCR擴增產(chǎn)物（496 bp)與拷貝數(shù)呈正比。泳道7:對照（WT) DNA,目的基-10:原代Tg鼠DNA。其目的基因擴增產(chǎn)物與標準DNA進行對比，口了得知其基因a b

Standard DMA x ^1x 2x 4x 8x 16x 32xbp Col3.5'GILZt)P Glucagon1 2 3 4 5 6 7 8 9 10圖1.候選建系鼠基因拷貝檢測1-6:標準DNA。無基因修飾背景的C57/B6鼠尾DNA中滲入不同拷貝的pCol3.6-GILZ-HA質(zhì)粒�；虻腜CR擴增產(chǎn)物（496 bp)與拷貝數(shù)呈正比。泳道7:對照（WT) DNA,目的基因為陰泳道8-10:原代Tg鼠DNA。其目的基因擴增產(chǎn)物與標準DNA進行對比，口了得知其基因拷貝數(shù)。

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本文編號：2797218