【摘要】：糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids, GC)不僅有導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的骨分解,還有促骨生成作用。然而目前尚不清楚什么因子介導(dǎo)GC的促骨生成作用。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)亮氨酸拉鏈蛋白(glucocorticoid-induced leucine zipper, GILZ)是GC誘導(dǎo)的一種抗炎介導(dǎo)因子。在本研究中,我們通過(guò)構(gòu)建骨特異性GILZ過(guò)表達(dá)Tg鼠,證實(shí)GILZ具有促進(jìn)在體骨生成的作用。 我們首先構(gòu)建GILZ-HA真核表達(dá)載體(Col3.6-GILZ-HA),其編碼基因由片段長(zhǎng)度為3.6kb的I型膠原啟動(dòng)子(Co13.6)驅(qū)動(dòng)。我們委托生物技術(shù)公司將目的基因植入C57BL/6小鼠基因組。在獲得原代轉(zhuǎn)基因鼠(Tg)后,我們繁育了三個(gè)獨(dú)立的鼠系,并根據(jù)它們的基因拷貝數(shù)和目的基因在骨組織中的表達(dá),篩選出最優(yōu)鼠系。該系Tg鼠骨組織GILZ表達(dá)明顯升高,與GC誘導(dǎo)的內(nèi)源性GILZ升高水平接近。Tg鼠在身長(zhǎng)、體重、采食、行為、繁殖能力等方面與同窩對(duì)照鼠(WT,外源基因陰性)均無(wú)明顯差異。 Tg鼠系建立以后,我們首先采用骨密度分析儀對(duì)3月齡鼠進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,與WT相比,Tg骨密度(BMD)和骨含量(BMC)均出現(xiàn)明顯升高,其中雄性BMD和BMC分別顯著增加12%和24%(p0.05),雌性BMD和BMC分別顯著增加12%和16%(p0.05)。 顯微CT掃描圖像三維重建發(fā)現(xiàn),與同窩WT相比,3月齡Tg鼠股骨遠(yuǎn)端骨體積(BV/TV)增加28%(p0.05)；骨小梁數(shù)量(Tb.N)顯著增加15%(p0.05)；骨小梁直徑(Tb.Th)顯著增加13%(p0.05)；骨小梁間隙(Tb.Sp)、連接系數(shù)(Conn. D)和結(jié)構(gòu)指數(shù)(SMI)無(wú)明顯差異(p0.05)。至6月齡,二者差異進(jìn)一步加大,Tg鼠BV/TV較WT增加73%；Tb.N增加53%;Tb.Th增加15%；Tb.Sp減少41%；Conn. D增加150%；SMI減少22%,差異均具有顯著性(p0.05)。骨量增加既可能是骨生成增加的結(jié)果,也可能是骨重吸收減少的結(jié)果。為確定Tg鼠骨生成是否增加,我們采用了鈣綠素雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察3月齡股骨的骨生成變化。結(jié)果證實(shí),Tg骨生成確實(shí)大幅度增加,其中：骨礦化率(mineral apposition rate, MAR)較WT增加2倍；礦化面積(MS/BS)增加26%；骨生成率(bone formation rate, BFR)增加2.5倍。骨脫鈣切片組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察發(fā)現(xiàn),Tg骨小梁上附著的成骨細(xì)胞(Osteoblasts,Ob)顯著增多。與WT相比,Tg在骨小梁上Ob密度(N.Ob/B.Pm)增加93%(p0.05)；成骨細(xì)胞面積(Ob.S/BS)增加46.7%。此外我們還觀(guān)察到Tg骨髓腔中,脂肪細(xì)胞有一定程度的減少。為了證明Ob數(shù)量增加是骨髓干細(xì)胞成骨分化增強(qiáng),成脂肪分化減弱的結(jié)果,我們進(jìn)行了骨髓集落生成單位(colony formation unit, CFU)分析。新鮮骨髓稀釋成單細(xì)胞懸液,以極低密度接種。給予常規(guī)培養(yǎng)液,或成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液,或成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液處理,在固定時(shí)間點(diǎn)分別固定細(xì)胞,給予Giemsa染色,以分析成纖維細(xì)胞集落(CFU-F);或油紅染色,以分析成脂肪細(xì)胞集落(CFU-Ad),或孵育堿性磷酸酶(ALP)底物,以分析成骨細(xì)胞集落(CFU-Ob)。 CFU-F分析顯示Tg與WT無(wú)顯著差異,說(shuō)明骨髓干細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯變化。而CFU-Ob顯示,Tg顯著高于WT；而CFU-Ad相反,Tg顯著低于WT。這說(shuō)明Tg骨髓細(xì)胞中,骨分化潛能的細(xì)胞比例增多。與之相對(duì)應(yīng),脂肪分化潛能細(xì)胞減少。 為了在基因水平檢驗(yàn)GILZ過(guò)表達(dá)對(duì)骨髓細(xì)胞的影響,我們采用實(shí)時(shí)定量Rt-PCR,分析體外培養(yǎng)原代骨髓細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子水平變化,發(fā)現(xiàn)在Tg骨髓細(xì)胞中,兩種關(guān)鍵性成骨調(diào)控因子,Runx2和Osx的基礎(chǔ)mRNA水平較WT分別增加2.4倍和4.7倍(p0.05)；而成脂肪調(diào)控因子PPARγ2則顯著下降,為WT水平的67.5%(p0.05)。經(jīng)過(guò)6天的成骨培養(yǎng)液誘導(dǎo),WT和Tg骨髓細(xì)胞的Runx2和Osx均上升。相比之下,WT上升幅度更大。Runx2的mRNA水平Tg僅為WT的1.2倍,差異不再顯著(p0.05),而Osx的mRNA水平Tg仍然高于顯著WT,是其2.7倍(p0.05)。PPARγ2的mRNA水平Tg與WT差距進(jìn)一步加大,降至WT的1%。上述結(jié)果說(shuō)明GILZ改變了骨髓細(xì)胞中調(diào)控因子的表達(dá),增加成骨凋控因子,降低成脂肪調(diào)控因子,使更多細(xì)胞傾向于成骨,而非成脂肪分化。 PPARγ2是控制骨髓干細(xì)胞成脂肪分化的關(guān)鍵因子。PPARγ2的表達(dá)需要C/EBPs蛋白參與。為進(jìn)一步明確GILZ與C/EBPs的相互作用。我們進(jìn)行了一系列蛋白-蛋白、蛋白-DNA相互作用的研究。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和GST-pull down實(shí)驗(yàn)均證實(shí),發(fā)現(xiàn),HA-GILZ可以與Flag-C/EBP蛋白一起被anti-Flag抗體所共沉淀。GILZ可與C/EBP蛋白牢固結(jié)合。在凝膠遷移(EMSA)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GILZ并不影響GST-C/EBPP與DNA結(jié)合的活性。相反,GILZ可以與C/EBPP共同結(jié)合DNA,形成蛋白-蛋白-DNA復(fù)合物,使C/EBPP與DNA結(jié)合增強(qiáng)。在DNA-pull down進(jìn)一步證實(shí)在細(xì)胞內(nèi),GILZ、C/EBPβ與DNA之間可以形成特異性的蛋白-蛋白-DNA復(fù)合物。GILZ可能與C/EBP形成異源二聚體,共同轉(zhuǎn)移至胞核并結(jié)合于結(jié)合位點(diǎn)。但GILZ-C/EBP二聚體不能激活下游PPARγ2勺表達(dá),相反還使其表達(dá)受抑制。 結(jié)論：GILZ具有促骨生成作用。在體環(huán)境下,GILZ可使Ob數(shù)量增多,骨組織體積增大,骨結(jié)構(gòu)改善,骨質(zhì)量和礦物質(zhì)沉積增加。GILZ的促骨生成機(jī)制包括：抑制成脂肪調(diào)控因子PPARγ表達(dá)；增加成骨調(diào)控因子Runx2、Osx等表達(dá)；刺激MSCs的成骨分化,抑制成脂肪分化。GILZ可能是迄今為止第一種被發(fā)現(xiàn)的GC誘導(dǎo)的促骨生成介導(dǎo)因子。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R336
【圖文】：
Ir.L.Th測(cè)量示意
圖1.候選建系鼠基因拷貝檢測(cè)準(zhǔn)DNA。無(wú)基因修飾背景的C57/B6鼠尾DNA中滲入不同拷貝的pCol3.6-GILZ-H的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（496 bp)與拷貝數(shù)呈正比。泳道7:對(duì)照（WT) DNA,目的基-10:原代Tg鼠DNA。其目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)DNA進(jìn)行對(duì)比，口了得知其基因a b
Standard DMA x ^1x 2x 4x 8x 16x 32xbp Col3.5'GILZt)P Glucagon1 2 3 4 5 6 7 8 9 10圖1.候選建系鼠基因拷貝檢測(cè)1-6:標(biāo)準(zhǔn)DNA。無(wú)基因修飾背景的C57/B6鼠尾DNA中滲入不同拷貝的pCol3.6-GILZ-HA質(zhì)粒。基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（496 bp)與拷貝數(shù)呈正比。泳道7:對(duì)照（WT) DNA,目的基因?yàn)殛幱镜?-10:原代Tg鼠DNA。其目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)DNA進(jìn)行對(duì)比，口了得知其基因拷貝數(shù)。
【相似文獻(xiàn)】
相關(guān)期刊論文 前10條
1 ;體內(nèi)骨生成評(píng)價(jià):快速定量分析方法[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).生物醫(yī)學(xué)工程分冊(cè);1999年02期
2 段榮帥;;骨成型蛋白質(zhì)-13(BMP-13)可抑制骨生成[J];食品與藥品;2009年07期
3 王偉;趙建華;高文魁;;鍶對(duì)骨生成的影響及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J];西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志;2009年05期
4 馬煥芝;曾炳芳;;高能震波促進(jìn)骨生成的實(shí)驗(yàn)與臨床研究進(jìn)展[J];上海醫(yī)學(xué);2008年12期
5 張韓;陳君柱;;骨生成蛋白及其受體信號(hào)途徑和肺動(dòng)脈高壓[J];國(guó)際心血管病雜志;2007年03期
6 張春才;禹寶慶;許碩貴;蘇佳燦;王家林;牛云飛;康慶林;付青格;任可;張鵬;高堂成;張雪松;嚴(yán)望軍;王冠軍;汪光曄;萬(wàn)岷;李波;孫建偉;王仁;叢永健;楊郁野;鄭醫(yī)紅;李格當(dāng);劉欣偉;管華鵬;;應(yīng)用生理性成骨力值概念治療骨折與骨不連——兼論MO現(xiàn)象與有效固定[J];中國(guó)骨傷;2007年06期
7 駱泉豐,王興;PGE2在骨生成和骨改建中的作用[J];現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志;2005年05期
8 王前，鐘世鎮(zhèn)，歐陽(yáng)鈞;鼠成骨細(xì)胞誘導(dǎo)體外骨生成的X線(xiàn)能譜分析[J];中華骨科雜志;1994年10期
9 張志勇;鄭文選;陳惠珍;李浩渤;田松波;;骨誘導(dǎo)性生物陶瓷材料肌內(nèi)種植實(shí)驗(yàn)研究[J];河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2009年07期
10 王元銀,何家才,王銀龍,周健,陳喬爾,程繼光,唐燕,葉金海;成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨形成的實(shí)驗(yàn)研究[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2000年04期
相關(guān)會(huì)議論文 前2條
1 鄭慶云;KatarinaT.Borer;;機(jī)械壓力、激素在運(yùn)動(dòng)促絕經(jīng)后女性骨生成中的作用[A];2011第九屆全國(guó)體育科學(xué)大會(huì)論文摘要匯編（1）[C];2011年
2 張彥定;高建民;林瑋;鄭翠芳;;人骨生成蛋白轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的制備[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第八屆會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2001年
相關(guān)重要報(bào)紙文章 前2條
1 記者 段涵敏 通訊員 王建新;首次發(fā)現(xiàn)骨生成新機(jī)制[N];湖南日?qǐng)?bào);2014年
2 記者 顏秋雨 通訊員 王玉林 王建新;中美專(zhuān)家揭示骨生成“三元調(diào)控”機(jī)制[N];健康報(bào);2014年
相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條
1 潘國(guó)棟;糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)亮氨酸拉鏈蛋白對(duì)骨生成的作用[D];武漢大學(xué);2014年
2 翟明明;脈沖電磁場(chǎng)對(duì)多孔鈦合金植入材料骨整合的影響及機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年
3 顏欣心;新型三維碳納米材料對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化的作用研究[D];華中科技大學(xué);2017年
4 黃偉;納米羥基磷灰石骨水泥注射防治松質(zhì)骨骨質(zhì)疏松骨折的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2002年
5 董青山;動(dòng)靜脈短路環(huán)法構(gòu)建血管化組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2009年
相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條
1 唐慧;三焦點(diǎn)牽張成骨在下頜骨缺損中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2008年
2 唐煥章;珍珠層人工骨復(fù)合成骨細(xì)胞的體內(nèi)成骨作用研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年
3 徐亦馳;醫(yī)用射釘型骨折內(nèi)固定系統(tǒng)的研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2016年
4 李想;復(fù)合rhBMP-2磷酸鈣骨水泥骨修復(fù)材料對(duì)缺損骨再生的影響[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2011年
本文編號(hào)：
2797218
