【摘要】：第一部分體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分化目的:本研究旨在通過(guò)條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(typeⅡalveolar epithelial cells,AEC2s)分化,為后續(xù)研究h UC-MSCs來(lái)源的AEC2s在肺部疾病中的治療作用奠定基礎(chǔ)。方法:h UC-MSCs分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組用小氣道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后添加生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)培養(yǎng);對(duì)照組用20%血清的DMEM/F12培養(yǎng)。第14天觀察細(xì)胞形態(tài);Western blot、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)和ELISA法檢測(cè)肺泡表面活性蛋白C(surfactant protein C,SP-C)及前肺泡表面活性蛋白C(pro-surfactant protein C,pro SP-C);透射電鏡觀察板層小體。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形向多邊形轉(zhuǎn)變,細(xì)胞內(nèi)有pro SP-C明顯表達(dá),培養(yǎng)基上清中有SP-C分泌,透射電鏡觀察到板層小體;而對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變,未檢測(cè)到pro SP-C表達(dá)、SP-C分泌和板層小體形成。結(jié)論:本研究結(jié)果表明體外誘導(dǎo)培養(yǎng)可促進(jìn)h UC-MSCs向AEC2s分化,通過(guò)該方法有望大量獲得h UC-MSCs來(lái)源的AEC2s用于肺部疾病治療研究。第二部分誘導(dǎo)來(lái)源Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞對(duì)肺纖維化模型小鼠的治療作用及機(jī)制初探目的:建立博來(lái)霉素(Bleomycin,BLM)引起的肺纖維化小鼠(pulmonary fibrosis,PF)模型,觀察誘導(dǎo)來(lái)源Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(h UC-MSCs-derived AEC2s)對(duì)肺纖維化模型小鼠的治療作用,討論其中可能的機(jī)制。方法:將C57BL/6小鼠分為空白對(duì)照組、安全性對(duì)照組、肺纖維化模型組、治療組,每組8只小鼠。10%水合氯醛(3ml/kg)麻醉后行氣管插管。肺纖維化模型組及治療組滴入博來(lái)霉素3 mg/kg,向空白對(duì)照組和安全性對(duì)照組滴入生理鹽水50μl。造模后第7 d,使用相同方法麻醉并氣管插管后,治療組及安全性對(duì)照組滴入h UC-MSCs-derived AEC2s細(xì)胞懸液,空白對(duì)照組及肺纖維化模型組滴入生理鹽水40μl。第21 d處死小鼠并采集標(biāo)本。統(tǒng)計(jì)生存率,觀察肺組織病理改變,分析肺組織膠原含量的變化及相關(guān)纖維化蛋白的表達(dá),免疫組化檢測(cè)pro SP-C表達(dá)。將h UC-MSCs-derived AEC2s和A549細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),探討h UC-MSCs-derived AEC2s對(duì)A549增殖的影響。結(jié)果:經(jīng)氣管插管給予博來(lái)霉素的肺纖維化模型組,與空白對(duì)照組比較,H.E染色顯示肺泡間隔增厚,Masson染色顯示纖維條索增加,并且肺內(nèi)膠原含量上升,肺內(nèi)α-sma和vimentin等纖維標(biāo)志物表達(dá)增強(qiáng),表明博來(lái)霉素小鼠模型構(gòu)建成功。h UC-MSCs-derived AEC2s治療肺纖維化模型小鼠,提高了其生存率,肺組織病理學(xué)顯示肺間隔增厚程度得到改善,肺內(nèi)炎性細(xì)胞聚集減少,膠原含量明顯降低,α-sma和vimentin表達(dá)下降,肺內(nèi)pro SP-C表達(dá)增加。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)h UC-MSCs-derived AEC2s可以促進(jìn)A549增殖。結(jié)論:h UC-MSCs-derived AEC2s可以改善博來(lái)霉素所致小鼠肺纖維化程度,有可能是通過(guò)促進(jìn)AEC2s增殖所起的作用。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R725.6;R-332
【圖文】：

樣品脫水和包埋。超薄切片后在日立 H-7500 透射電鏡下觀察拍照。.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)運(yùn)用 SPSS 11.5 軟件進(jìn)行顯著性差異分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X示，兩組之間均數(shù)比較采用 t 檢驗(yàn)，當(dāng) p＜0.05 時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果.1 細(xì)胞形態(tài)在 DMEM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第 4 代的 hUC-MSCs 在光鏡下呈長(zhǎng)梭形，不一向外伸出的突起并且在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中可以觀察到螺旋狀匯合。在小皮細(xì)胞生長(zhǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng) 2 d 后，細(xì)胞間連接改變。在條件培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d 可明顯觀察到細(xì)胞骨架，細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變?yōu)楸馄綘�，將�?xì)胞消化鋪板，在貼壁后可觀察到細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形并有立體感。0 d 2 d

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文MSCs 誘導(dǎo)前后細(xì)胞干性檢測(cè)表面間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè)EM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 hUC-MSCs 表面分子 CD34、CD45 2%，CD73、CD90、CD105 陽(yáng)性率高于 95%，符合 2006 年發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)[10]。誘導(dǎo)來(lái)源的 AEC2s 表面 CD34、CD45、HL2%, CD73 和 CD105 陽(yáng)性率明顯降低，低于 80%, CD90 陽(yáng)性95%。

26圖 1-3 誘導(dǎo)來(lái)源的 AEC2s 表面間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物Figure1-3 hUC-MSCs-derived AEC2s CD marker分化EM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 hUC-MSCs 通過(guò)誘導(dǎo)可以分化細(xì)胞。而誘導(dǎo)來(lái)源的 AEC2s 不能在成骨、成脂或成軟骨

【參考文獻(xiàn)】

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1 高黎;祝華;張榮;王莉佳;鄒琳;符州;;BrdU標(biāo)記人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為影響的體外研究[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年11期

2 中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組全國(guó)兒童彌漫性肺實(shí)質(zhì)疾病/肺間質(zhì)疾病協(xié)作組;趙順英;農(nóng)光民;;兒童肺間質(zhì)疾病診斷程序?qū)＜夜沧R(shí)[J];中華兒科雜志;2013年02期

3 陳寅;馬南;梅舉;肖海波;陸善偉;徐懷陽(yáng);鐘z

本文編號(hào)：2787058