【摘要】：背景:在胸腺中,T細胞的增殖和分化需經(jīng)過一系列具有特異性表達和調節(jié)的基因的多重檢查點的嚴格調控。胸腺細胞分為以下幾個階段:DN(CD4~-CD8~-Double-negative,雙陰性)階段,DP(CD4~+CD8~+Double-positive,雙陽性)階段和CD4 SP(CD4~+CD8~-single-positive,CD4單陽性)和CD8 SP(CD4~-CD8~+single-positive,CD8單陽性)階段。其DN階段又根據(jù)復雜的調控,并且最終以CD44和CD25為細胞表面標志進行具體的劃分,包括DN1(CD25~-CD44~+),DN2(CD25~+CD44~+),DN3(CD25~+CD44~-)和DN4(CD25~-CD44~-)階段。TCR(T cell receptor,T細胞受體)能夠誘導胸腺細胞存活、增殖和分化的不依賴配體的激活信號的活化。TCR在胸腺細胞的分化發(fā)育過程中同樣也發(fā)揮了重要的作用。TCR是富含核心巖藻糖基化的糖蛋白。Fut8(core fucosyltransferase,核心巖藻糖基轉移酶)介導的核心巖藻糖基化是一種重要的翻譯后修飾過程,并且已顯示了其修飾對于細胞表面上各種糖蛋白分子的功能和穩(wěn)定性是必需的。Fut8通過核心巖藻糖基修飾能改變底物蛋白的構象、表達及定位,在哺乳動物細胞中發(fā)揮了重要作用。目的:利用Fut8基因敲除(Fut8~(-/-))小鼠與正常(Fut8~(+/+))小鼠,探究Fut8在小鼠胸腺中T細胞的分化發(fā)育的調節(jié)作用,主要探究TCR的核心巖藻糖基化對于胸腺DP階段發(fā)育的重要性。方法:將4~8周齡的Fut8~(+/+)小鼠的胸腺細胞進行分選,利用FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter,流式細胞儀)檢測不同發(fā)育階段的細胞表面的核心巖藻糖基化。利用同窩出生的Fut8~(+/+)和Fut8~(-/-)小鼠為對象,通過流式細胞儀分選出各個階段DN1、DN2、DN3、DN4、DP CD4 SP及CD8 SP的細胞,然后進行計數(shù),并探究核心巖藻糖基化的缺失對小鼠胸腺細胞發(fā)育不同階段的細胞數(shù)目的影響。利用IP(Immunoprecipitation,蛋白免疫沉淀),Western Blot(蛋白質免疫印跡)和FACS檢測DP細胞TCR及TCR上核心巖藻糖基化的差異。在利用Western Blot檢測DP細胞磷酸化的水平后,為了進一步探究TCR核心巖藻糖基化在DP階段的作用,我們利用特異性切割核心巖藻糖糖苷鍵(β1-6)的糖苷酶處理TCR特異性轉基因OT-I和OT-II小鼠的DP細胞,再利用Western Blot檢測TCR的核心巖藻糖基化的改變對信號轉導的影響,同時也利用MTT和細胞克隆形成實驗檢測細胞的增殖能力。最后利用Q-PCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System,熒光實時定量聚合酶鏈式反應)檢測與胸腺發(fā)育相關的轉錄因子的變化。結果:通過流式結果分析發(fā)現(xiàn)核心巖藻糖基化在胸腺細胞不同發(fā)育階段的表達是一個動態(tài)變化的過程,其在胸腺細胞在由DN階段向DP階段轉變過程中顯著增多。核心巖藻糖基化的缺失導致胸腺中DP細胞數(shù)目明顯減少。對DP胸腺細胞的研究結果表明,與Fut8~(+/+)DP細胞相比,Fut8~(-/-)DP細胞的增殖能力及磷酸化水平明顯減弱。并且我們發(fā)現(xiàn),TCR上核心巖藻糖基化的缺失,會使TCR的信號轉導能力下降,并且細胞增殖也減弱。Q-PCR結果顯示,Fut8~(-/-)DP細胞中與胸腺細胞分化密切相關的轉錄因子Id2及E2a的表達異常。結論:在小鼠胸腺中,核心巖藻糖基化修飾在T細胞的正常分化中發(fā)揮重要調節(jié)作用,并且發(fā)現(xiàn)TCR的核心巖藻糖基化對調節(jié)DP階段的胸腺發(fā)育至關重要。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392
【圖文】：

結果1. 核心巖藻糖基化在整個胸腺細胞分化過程中的動態(tài)變化糖基化能夠影響 T 細胞的發(fā)育，生存和相關的代謝反應[6-11]。為了檢測核藻糖基化在胸腺發(fā)育中可能存在的調節(jié)作用，我們利用能夠特應性識別核心巖糖基化結構的 LCA 對分選出的 Fut8+/+小鼠的不同發(fā)育階段的胸腺細胞進行染利用細胞表面標記物，CD4 和 CD8 進行細胞染色后，分選 DN、DP、CD4 SP、SP 細胞，然后將 DN、DP、CD4 SP、CD8 SP 細胞分別進行 LCA 染色。利用 Fl進行分析后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ut8+/+小鼠 DP 比 DN 胸腺細胞的核心巖藻糖基化水平顯著（**P<0.01）（圖 1.1A）。同時在胸腺細胞發(fā)育 CD4 SP、CD8 SP 階段，核心巖基化水平仍然保持著較高的水平（圖 1.1B）。

大連醫(yī)科大學碩士學位論文binding on thymic subpopulations (n=6). (**p＜0.01)2. Fut8-/-胸腺細胞表面的核心巖藻糖基化消失我們將對 Fut8+/+和 Fut8-/-胸腺細胞進行流式細胞分析，比較 Fut8+/+和 Fut8-/-胸腺細胞各發(fā)育階段的 LCA 染色情況。Fut8-/-胸腺細胞在 DN、DP、CD4 SP 及 CD8 SP階段的 LCA 染色為陰性（圖 1.2）。雖然 Fut8+/+DN、DP、CD4 SP 及 CD8 SP 階段表達情況不同，但各階段細胞均顯示 LCA 染色陽性。

結果1. Fut8-/-小鼠顯示胸腺發(fā)育異常為了探索在小鼠體內 Fut8 與胸腺發(fā)育的關系，我們將同窩出生四周的 Fut8+/和 Fut8-/-小鼠的全胸腺進行對比，如圖 2.1A 所示，F(xiàn)ut8-/-小鼠胸腺較 Fut8+/+小鼠的胸腺明顯偏小。通過 HE 免疫組化染色分析，F(xiàn)ut8-/-小鼠的髓質明顯減少(圖 2.1B)因為髓質中分布有較成熟的胸腺細胞，因此推測 Fut8-/-小鼠較成熟胸腺細胞的數(shù)量會受到影響。LCA 的染色結果顯示，F(xiàn)ut8+/+小鼠的整個胸腺中核心巖藻糖基高表達而 Fut8-/-小鼠中則幾乎沒有表達(圖 2.1B）。通過胸腺細胞全蛋白的 AAL[24]和 LC染色，我們發(fā)現(xiàn)在 Fut8-/-鼠中核心巖藻糖基化消失(圖 2.1C)。說明 Fut8 的缺失與胸腺分化發(fā)育密切相關。

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 秦思棟;腸上皮內CD8~+淋巴細胞上γ-δT細胞受體的表達[J];國外醫(yī)學(免疫學分冊);1989年05期

2 陳曉彤;劉寶瑞;;T細胞受體工程化T細胞抗腫瘤治療的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)[J];中國腫瘤生物治療雜志;2018年08期

3 王坤;金靜君;楊婷;韓俊永;陳金煙;薛士杰;劉慎敏;;熒光定量PCR檢測T細胞受體刪除環(huán)在親緣與非親緣異基因造血干細胞移植后免疫重建早期的應用[J];福建醫(yī)藥雜志;2017年05期

4 吳志華;荊敏;梁韓英;楊昒;黃雅萍;陳曉明;胡建華;范駿;;異基因造血干細胞移植受者T細胞受體β鏈CDR3譜型表達與巨細胞病毒激活[J];浙江大學學報(醫(yī)學版);2016年05期

5 曹水,任秀寶,郝希山;骨髓移植前后免疫系統(tǒng)功能評估[J];天津醫(yī)科大學學報;2004年04期

6 馬麗平;李蘊;趙文明;劉振龍;;pTARGET-TCR Vβ5.2真核表達質粒的構建及表達[J];免疫學雜志;2007年01期

7 牟艷芳;張文峰;邵紅偉;黃樹林;;T細胞受體基因轉導及應用的研究進展[J];廣東藥學院學報;2009年01期

8 李志剛;以IgH/TCR重排為靶分子的PCR急淋白血病微小殘留病檢測的現(xiàn)狀和進展[J];國外醫(yī)學.輸血及血液學分冊;2002年02期

9 陶嫦立;黃樹林;;TCR基因免疫治療中優(yōu)化轉TCR基因配對的研究進展[J];中國生物工程雜志;2016年03期

10 姚文娟;房永祥;劉泰安;王春燕;景志忠;;豬T細胞受體β鏈轉錄組與基因組分子結構研究進展[J];細胞與分子免疫學雜志;2015年07期

相關會議論文 前4條

1 姚利;;成人急性淋巴細胞白血病患者的克隆性免疫球蛋白和T細胞受體基因重排模式[A];蘇州市自然科學優(yōu)秀學術論文匯編(2008-2009)[C];2010年

2 張詩軍;陳澤雄;秦鑒;黃必軍;勞紹賢;;和解湯對慢性乙型肝炎T細胞受體Vβ7基因表達的影響[A];第十三次全國中西醫(yī)結合肝病學術會議論文匯編[C];2004年

3 景志忠;莫斯科;馮海燕;李玩生;王生富;房永祥;陳國華;曾爽;賈懷杰;;豬病原抗原免疫識別關鍵分子基因結構與多樣性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜寄生蟲學分會第六次代表大會暨第十次學術研討會論文集[C];2009年

4 朱霞;歐元;郭曉玲;朱平;;慢性血小板減少性紫癜發(fā)病相關的T細胞克隆特征[A];第四屆全國RNA進展研討會論文集[C];2005年

相關博士學位論文 前6條

1 張瑞萍;表達嵌合T細胞受體的T淋巴細胞介導的腫瘤過繼性免疫治療作用機理研究[D];第二軍醫(yī)大學;2005年

2 楊志;北京鴨T細胞受體基因的研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2015年

3 宣麗;G-CSF動員后外周血T細胞受體譜系以及γδT細胞功能亞群變化的研究[D];南方醫(yī)科大學;2014年

4 林宗偉;動脈粥樣硬化T細胞克隆變化及通過let-7e調控血管內皮功能的研究[D];山東大學;2017年

5 徐瑩;T細胞受體變化對慢乙肝抗病毒治療結局的影響[D];南方醫(yī)科大學;2017年

6 孫龍昊;AFP_(158-166)特異性TCR轉基因T細胞治療肝癌的實驗研究[D];天津醫(yī)科大學;2014年

相關碩士學位論文 前10條

1 毛姍姍;T細胞受體的核心巖藻糖基化調節(jié)雙陽性（DP）階段的胸腺發(fā)育[D];大連醫(yī)科大學;2018年

2 崔媛媛;結直腸癌患者圍術期T細胞受體多樣性變化的臨床研究[D];暨南大學;2017年

3 雷蕾;Tespal調控T細胞受體信號傳導的分子機制研究[D];浙江大學;2013年

4 徐敏;蕈樣肉芽腫T細胞受體基因重排的分子生物學診斷研究[D];天津醫(yī)科大學;2008年

5 任國良;我國HIV感染不同疾病進展者TCR基因多樣性特征的初步研究[D];中國疾病預防控制中心;2009年

6 陳增超;TCR免疫組庫對食管鱗癌免疫治療的指導研究[D];山東大學;2016年

7 馮海燕;豬T細胞受體α、β鏈基因的克隆、多態(tài)性分析及α鏈基因的表達[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2009年

8 王率;一種新的受體修飾T細胞免疫治療腫瘤的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學;2002年

9 黃yN諾;抗病毒治療乙肝病人TCR可變區(qū)的深度測序分析[D];河南大學;2014年

10 劉海亮;三種免疫細胞聯(lián)合治療結直腸癌的臨床效應及機制研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2013年

本文編號：2786731