【摘要】：第一章人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及鑒定 目的： 建立本實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定分離擴(kuò)增hBMSCs的方案并評(píng)估獲取的細(xì)胞是否為hBMSCs,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法：采用直接貼壁法和密度梯度離心法同時(shí)分離hBMSCs,比較原代培養(yǎng)過程中集落出現(xiàn)時(shí)間、集落數(shù)目、P3代細(xì)胞生長曲線；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P3代細(xì)胞表面抗原CD34、CD44、CD45的表達(dá)情況；成骨、成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)所獲得細(xì)胞向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化,以茜素紅及油紅O染色法鑒定成骨分化中鈣結(jié)節(jié)及成脂分化中脂滴的形成。 結(jié)果： 直接貼壁法和密度梯度離心法均能分離得到hBMSCs。直接貼壁法集落出現(xiàn)時(shí)間較密度梯度離心法短,集落數(shù)目多于密度梯度離心法,細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于密度梯度離心法；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)直接貼壁法獲得的P3代細(xì)胞CD34陽性率2.18%,CD44陽性率98.14%,CD45陽性率0.41%。成骨誘導(dǎo)后以茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié),成脂誘導(dǎo)后油紅O染色可見脂滴形成。 結(jié)論： 1、直接貼壁法和密度梯度離心法均能分離得到lhBMSCs; 2、綜合比較集落出現(xiàn)時(shí)間、集落數(shù)目、細(xì)胞增殖能力,直接貼壁法優(yōu)于密度梯度離心法； 3、經(jīng)鑒定分離得到的為hBMSCs,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了穩(wěn)定的細(xì)胞來源。 目的： 探討人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向感覺神經(jīng)元誘導(dǎo)的可能性。 方法： RT-PCR檢測(cè)RA、Shh、Wnt信號(hào)通路相關(guān)RARα、RARβ、RARγ、PTCH1、 Smoothened、Gli1、Gli2、Gli3、Frizzled、β-catenin在獲得的hBMSCs中表達(dá)情況； 使用RA、Shh、Wnt1、RA+Shh、RA+Wnt1、Shh+Wntl、RA+Shh+Wntl共7組進(jìn)行感覺神經(jīng)元誘導(dǎo),觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)改變,熒光定量PCR檢測(cè)神經(jīng)元相關(guān)基因β-tubulin3、MAP-2、Tau、GATA-3、Calretinin、Brn3a在各誘導(dǎo)組及hBMSCs中表達(dá)情況,免疫熒光檢測(cè)誘導(dǎo)后感覺神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)志GATA-3、Calretinin、Brn3a在各誘導(dǎo)組中表達(dá)情況,比較各組之間差異。 結(jié)果： RARα、RARβ、RARγ、PTCH1、Smoothened、Gli1、Gli2、Gli3、Frizzled、 β-catenin在hBMSCs中存在不同程度表達(dá)；各誘導(dǎo)組中均可獲得神經(jīng)元樣細(xì)胞,免疫熒光顯示RA+Shh組、RA+Shh+Wntl組中可見GATA3、Calretinin日性細(xì)胞,Wntl組、RA+Wntl組、Shh+Wntl組、RA+Shh+Wntl組中可Brn3a陽性細(xì)胞；熒光定量PCR結(jié)果示β-tubulin3、MAP-2、Tau在各誘導(dǎo)組中均較未誘導(dǎo)組表達(dá)上調(diào),有顯著性差異,各誘導(dǎo)組之間相對(duì)表達(dá)量無明顯差別。GATA3在RA+Shh組、RA+Shh+Wntl組中較未誘導(dǎo)組增高倍數(shù)較大,分別為24.4倍、68.1倍,兩組與未誘導(dǎo)組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,RA+Shh+Wntl組與RA+Shh組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Calretinin在RA+Shh組、RA+Shh+Wntl組中較未誘導(dǎo)組增高倍數(shù)較大,分別為339.2倍、572.9倍,兩組與未誘導(dǎo)組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,RA+Shh+Wntl組與RA+Shh組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Brn3a在Wntl、RA+Wntl、Shh+Wntl、 RA+Shh+Wntl組較未誘導(dǎo)組均有顯著性差異,分別增高143.0倍、94.2倍、132.3倍、424.3倍。 結(jié)論： 1、培養(yǎng)的hBMSCs中存在RA、Shh、Wnt作用基礎(chǔ)； 2、Shh和RA單獨(dú)誘導(dǎo)hBMSCs無法獲得GATA3、CalretininP日性表達(dá)神經(jīng)元樣細(xì)胞,Shh和RA聯(lián)合誘導(dǎo)hBMSCs可獲得GATA3、Calretinin陽性表達(dá)神經(jīng)元樣細(xì)胞,但不能獲得Brn3a陽性細(xì)胞。Wntl單獨(dú)誘導(dǎo)hBMSCs可獲得Brn3a陽性表達(dá)神經(jīng)元樣細(xì)胞。RA+Shh+Wntl組在各誘導(dǎo)組中具有最佳誘導(dǎo)效果,可獲得GATA3、Calretinin、Brn3a陽性表達(dá)的感覺神經(jīng)元樣細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329
【圖文】：

集落開始出現(xiàn)。集落細(xì)胞形態(tài)以梭性為主，飽滿折光性強(qiáng)，集落中央有雜質(zhì)，細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，集落變大（圖1-C、D、E、F)，呈旋禍狀生長，至第8天左右集落變大至相互匯合在一起，當(dāng)匯合度約70%時(shí)，將P0傳代至P1(圖1-G、H、I、J)o傳代后細(xì)胞分布均勾，生長速度較原代快，傳代后30min,細(xì)胞即貼壁，此時(shí)細(xì)胞為圓形，至24小時(shí)后，細(xì)胞呈典型梭形（圖1-G、H)，旋禍狀生長

hBMSCs在加入成骨誘導(dǎo)液后，細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生變化，由長梭形變?yōu)槎嘟切危T導(dǎo)至21天時(shí)茜素紅染色可見大量橘紅色韓結(jié)節(jié)（圖4-A、B)，說明培養(yǎng)的hBMSCs具有分化為成骨細(xì)胞能力，產(chǎn)生媽鹽沉積。1.4.4成脂誘導(dǎo)hBMSCs在加入成脂誘導(dǎo)液后，細(xì)胞逐漸由長梭形變?yōu)閳A形，胞體中出現(xiàn)空泡，誘導(dǎo)至9天時(shí)油紅0染色可見大量紅色脂滴（圖4-C、D)，說明培養(yǎng)的hBMSCs具有分化為脂肪細(xì)胞的能力，產(chǎn)生脂滴。■ HA成骨誘導(dǎo)茜素紅染色（40X) B成骨誘導(dǎo)茜素紅染色（100X)PiW

本文編號(hào)：2778316