【摘要】：硫化氫(hydrogen sulfide, H_2S)是一種無(wú)色、有臭雞蛋氣味的氣體。長(zhǎng)時(shí)間以來(lái),它被認(rèn)定為是一種有毒的氣體,大量吸入會(huì)導(dǎo)致中毒,其毒性作用主要通過(guò)抑制線粒體的細(xì)胞色素C氧化酶,影響呼吸鏈的活動(dòng),從而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的活動(dòng)。直到1989年,人們?cè)诖笫蠛腿四X中檢測(cè)到了內(nèi)源性H_2S,以及接下來(lái)發(fā)現(xiàn)的催化它產(chǎn)生的三種酶,說(shuō)明H_2S可能具有一定的生理作用。越來(lái)越多的研究表明,H_2S在機(jī)體內(nèi)的各個(gè)系統(tǒng)中都發(fā)揮著非常重要的作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中,H_2S既可以作為神經(jīng)調(diào)節(jié)因子對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的功能進(jìn)行調(diào)控,也可以作為神經(jīng)保護(hù)因子對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮其保護(hù)效應(yīng)。神經(jīng)元中,它可以增強(qiáng)NMDA受體活性,易化長(zhǎng)時(shí)程動(dòng)作電位的產(chǎn)生,對(duì)記憶過(guò)程產(chǎn)生影響。在心血管系統(tǒng)中,H_2S通過(guò)開(kāi)放血管平滑肌細(xì)胞上ATP敏感的鉀通道(KATP通道),引起血管平滑肌細(xì)胞舒張,降低血壓。在缺血再灌注模型中,它可以減小心梗面積,改善心梗后左心室功能。消化系統(tǒng)中,H_2S可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取,增加葡萄糖耐量和胰島素敏感性。鑒于H_2S對(duì)身體各個(gè)系統(tǒng)的重要的調(diào)節(jié)作用,還有它是一種小分子量的氣體分子,能穿透細(xì)胞膜直接起效,在體內(nèi)產(chǎn)生并受內(nèi)源性關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié),生理濃度時(shí)有明確的功能并能被外源性氣體模擬,H_2S成為繼一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)之后的第三個(gè)氣體信號(hào)分子。血管新生是指在原有血管的基礎(chǔ)上通過(guò)血管外基質(zhì)降解,血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移形成子代血管支并具有血運(yùn)功能的一個(gè)過(guò)程。它可發(fā)生于組織生長(zhǎng)發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)和腫瘤生長(zhǎng)等多種生理、病理過(guò)程中。在血管新生方面,我課題組于2007年在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)外源性H_2S具有顯著的促血管新生作用。它不僅可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,遷移和管腔形成,還可以在小鼠Matrigel Plug動(dòng)物模型上促進(jìn)血管的新生。隨后Szabo C等在雞胚絨毛膜尿囊(CAM)模型中也證實(shí)了H_2S的促血管新生效應(yīng)。缺血性疾病是一種臨床上常見(jiàn)的高致殘率、高致死率的疾病,它是由病理或者外界損傷導(dǎo)致機(jī)體動(dòng)脈或者靜脈血流急劇降低或中斷,使得該血管的血供區(qū)失去氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給造成的。傳統(tǒng)的缺血性疾病的治療方法側(cè)重于血管的再通,而忽略了血管再灌時(shí)對(duì)微循環(huán)的傷害,于是誕生了治療性血管新生(therapeutic angiogenesis)。它是指將外源性血管新生誘導(dǎo)因子(如VEGF.bFGF)或其基因片段或干細(xì)胞轉(zhuǎn)入缺血組織中,增強(qiáng)缺血區(qū)的側(cè)支毛細(xì)血管新生,改善缺血區(qū)的血流,促進(jìn)缺血區(qū)血供恢復(fù)。正常生理狀態(tài)下,H_2S可以明顯地促進(jìn)血管新生,在疾病狀態(tài),如組織缺血時(shí),H_2S是否也能促進(jìn)血管新生,以及促進(jìn)缺血組織血管新生的機(jī)制是什么,具有重要的研究?jī)r(jià)值。因此在本文中,我們將重點(diǎn)探討H_2S在不同缺血模型中的促血管新生作用及其作用機(jī)制,為治療性血管新生提供新的策略。首先,我們觀察了外源性NaHS腹腔注射連續(xù)4 W對(duì)大鼠缺血下肢血管新生的影響。熒光微球法測(cè)血流結(jié)果顯示,NaHS 20和50μmol/kg/day腹腔注射連續(xù)4 W,能夠顯著改善缺血下肢的血流供應(yīng)；血管造影發(fā)現(xiàn),NaHS 50和100 μmol/kg/day慢性給藥組的側(cè)枝血管形成最多；免疫組化結(jié)果表明各濃度的NaHS處理組能夠不同程度地促進(jìn)缺血下肢微血管的生成,以NaHS 50μmol/kg/day處理組效果最為顯著；50μmol/kg/day的NaHS慢性給藥組還能夠顯著提高增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)在兩種細(xì)胞上的表達(dá),促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的增殖；在缺血下肢中,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)主要表達(dá)在骨骼肌細(xì)胞上,且不同劑量的NaHS腹腔注射連續(xù)4 W,能夠不同程度地提高VEGF的表達(dá)；而VEGF受體2型(vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)和phospho-VEGFR2主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞上,NaHS不改變VEGFR2的表達(dá)量,但是能夠顯著增強(qiáng)VEGFR2的磷酸化；而且NaHS也能夠提高缺血組織中Akt的磷酸化水平。以上結(jié)果說(shuō)明,NaHS確實(shí)能夠促進(jìn)大鼠缺血下肢的血管新生,改善缺血區(qū)的血供,該作用可能和促進(jìn)缺血區(qū)骨骼肌細(xì)胞中VEGF的表達(dá)以及內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFR2的磷酸化有關(guān)。其次,我們成功建立了小鼠的心梗模型。并利用心電圖(electrocardiogram, ECG)、心超、Evans' Blue-TTC染色和蘇木精-伊紅染色法(hematox ylin- eosin staining,HE染色)等技術(shù),驗(yàn)證心梗模型是否成功。心梗手術(shù)后,小鼠心臟前壁變白,心跳減緩；ECG顯示,ST段(J點(diǎn))抬高,呈現(xiàn)缺血性變化；心超結(jié)果顯示,與sham組相比,手術(shù)組EF和FS值明顯降低；心肌酶譜檢測(cè)結(jié)果顯示,血漿中LDH、CK和CK-MB含量升高；Evans'Blue-TTC染色可以明顯地看到變白的梗死區(qū)域；HE染色可以看到心梗后2 W,梗死區(qū)被大量纖維組織代替。以上檢測(cè)手段都說(shuō)明,小鼠心梗模型建立成功。再次,我們?cè)诔晒⒌男∈笮墓ＤＰ偷幕A(chǔ)上,觀察了H_2S對(duì)小鼠心梗后血管新生情況和心肌保護(hù)作用。免疫組化結(jié)果表明,NaHS 50μmol/kg/day腹腔注射2 W能夠促進(jìn)心臟危險(xiǎn)區(qū)微血管的形成,緩解缺血導(dǎo)致的心功能損傷；而且不同劑量的NaHS腹腔注射4 W都能降低小鼠的死亡率,尤其以NaHS 50 μmol/kg/day給藥組小鼠的死亡率最低；ELISA的結(jié)果顯示,外源性H_2S處理并不改變?nèi)毖募〗M織中VEGF的含量；卻顯著增加CSE、CBS和3-MST的蛋白表達(dá),并且升高血漿中H_2S的含量。接下來(lái),我們利用CSE基因敲除的小鼠,初步觀察了內(nèi)源性H_2S在促血管新生中的作用。結(jié)果顯示,CSE基因敲除小鼠心梗后,微血管形成數(shù)量更少；此時(shí),雖然CBS和3-MST蛋白表達(dá)明顯升高,但是血漿中H_2S含量更低；同時(shí),心梗后組織中VEGF的含量明顯降低。以上結(jié)果說(shuō)明了內(nèi)源性H_2S在心梗后血管新生中也起到一定的作用。最后,我們利用培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞,觀察了H_2S對(duì)缺氧下心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。LDH和CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示,缺氧6h后,心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重,細(xì)胞活力降低；NaHS處理能夠明顯改善這種狀況；western blot和ELISA的結(jié)果顯示,缺氧后心肌細(xì)胞VEGF表達(dá)和分泌都升高,但是NaHS并不影響VEGF的表達(dá)和分泌；缺氧后心肌細(xì)胞內(nèi)CSE和3-MST蛋白表達(dá)不變,CBS蛋白表達(dá)明顯升高;NaHS處理升高CBS的表達(dá),但是不影響CSE和3-MST的表達(dá)。同時(shí),HPLC-MS檢測(cè)結(jié)果顯示,缺氧時(shí)心肌細(xì)胞培液中H_2S含量降低,NaHS處理后能夠升高培液中H_2S的含量。利用CSE SiRNA敲低CSE的表達(dá)后,CSE蛋白表達(dá)降低,同時(shí)培液中H_2S含量明顯降低；LDH和CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示,細(xì)胞損傷更加嚴(yán)重,說(shuō)明內(nèi)源性的H_2S在保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞中的作用。綜上所述,本文通過(guò)以上一些列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H_2S可以促進(jìn)大鼠缺血下肢的血管新生,該作用可能和VEGF介導(dǎo)的旁分泌作用有關(guān)；H_2S可以促進(jìn)小鼠心梗后的血管新生,緩解缺血對(duì)心臟的損傷,該作用可能和三種酶的表達(dá)有關(guān)系；內(nèi)源性H_2S在促進(jìn)心梗后血管新生中具有重要作用；H_2S可以保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞的損傷,可能和培液中H_2S含量升高有關(guān)系,而且內(nèi)源性的H_2S在其中也發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2778308