本文關(guān)鍵詞：生長(zhǎng)停滯特異性蛋白-6對(duì)血管平滑肌細(xì)胞衰老影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景衰老是身體機(jī)能、適應(yīng)性以及抵抗力隨著時(shí)間的推移而逐漸降低的一種現(xiàn)象。現(xiàn)如今,隨著全球人口老齡化步伐的加快,衰老正逐步成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)：由于衰老與人類(lèi)的壽命以及生活質(zhì)量關(guān)系密切,因此,能否延緩衰老對(duì)于提高人們的生活質(zhì)量以及延長(zhǎng)壽命尤為重要。研究顯示,衰老逐步成為心血管系統(tǒng)的首要危險(xiǎn)因素：衰老可以影響心血管系統(tǒng)的代謝并因此導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的代謝紊亂、異常的細(xì)胞死亡以及炎癥的發(fā)生；從而使心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,最終導(dǎo)致心血管重構(gòu)。Growth arrest-specific protein 6 (Gas6)是由growth arrest-specific gene 6(gas6)基因所編碼的一種分泌型蛋白,隸屬于維生素K依賴(lài)性蛋白家族成員。多項(xiàng)研究顯示Gas6/Axl信號(hào)參與血管鈣化、血管重塑以及動(dòng)脈粥樣硬化等病理生理過(guò)程。此外,基因多態(tài)性分析顯示,gas6基因與急性冠脈綜合征以及中風(fēng)關(guān)系密切。根據(jù)上述觀(guān)點(diǎn)和理論可以推斷：Gas6/Axl信號(hào)與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要的理論和實(shí)際意義。然而,Gas6/Axl信號(hào)對(duì)心血管系統(tǒng)衰老的影響以及具體的作用機(jī)制尚不明確。因此,本研究將對(duì)Gas6/Axl信號(hào)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)衰老的影響進(jìn)行研究探討。研究目的1.探討Gas6對(duì)細(xì)胞衰老的影響2.探討Gas6對(duì)細(xì)胞衰老影響下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路3.探討Gas6參與細(xì)胞衰老調(diào)節(jié)的具體作用機(jī)制材料方法本研究以MOVAS小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞系及原代培養(yǎng)的小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象,應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western Blotting)、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色(Senescence-associated β-galactosidase staining, SA-β-Gal)、流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染小干擾RNA (si-RNA)、以及EdU熒光標(biāo)記法等實(shí)驗(yàn)方法,分別觀(guān)察以下指標(biāo)：1.細(xì)胞衰老模型的建立以及鑒定情況。2.使用多個(gè)濃度梯度的Gas6蛋白刺激原代細(xì)胞,通過(guò)檢測(cè)p16INK4a和p21Cipl蛋白表達(dá)情況以及β-半乳糖苷酶染色率情況,得出Gas6刺激的最佳時(shí)間點(diǎn)以及最適濃度。3.給予細(xì)胞重組游離型Axl蛋白(Axl-Fc)刺激,用以中和細(xì)胞上清中的Gas6,降低其上清中的濃度。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞p16INK4a和p21Cipl衰老相關(guān)蛋白表達(dá)情況以及β-半乳糖苷酶染色率的情況。4.使用Axl特異性阻斷劑R428干預(yù)細(xì)胞,觀(guān)察細(xì)胞的衰老情況。5. 使用流式細(xì)胞技術(shù)和EdU標(biāo)記法分別檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖情況,分析以上六組細(xì)胞周期分布情況以及細(xì)胞增殖變化。6. 分別使用Axl和磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)的特異性阻斷劑R428和LY294002刺激兩個(gè)衰老模型的細(xì)胞,分別觀(guān)察下游分子PI3K、Akt、FoxO3a、P27Kipl和cyclin E以及Akt、FoxO3a、p27Kipl和cyclin E表達(dá)改變情況。7.使用設(shè)計(jì)、化學(xué)合成FoxO3a siRNA,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MOVAS細(xì)胞系,以抑制FoxO3a的合成和表達(dá),觀(guān)察FoxO3a對(duì)細(xì)胞周期的影響。結(jié)果1.衰老模型的鑒定衰老相關(guān)p半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色和Western Blotting結(jié)果顯示,當(dāng)原代VSMC傳至第10代時(shí),細(xì)胞SA-β-Gal染色率可達(dá)80%以上,較對(duì)照組明顯增加(P0.001)；另外,衰老相關(guān)分子指標(biāo)p16INK4a和p21Cipl較對(duì)照組(第3代)明顯增加(P0.001,P0.001)。我們選用第4代原代VSMC,使用1*10-6mol/L濃度的血管緊張素Ⅱ連續(xù)刺激48小時(shí)后的細(xì)胞作為誘導(dǎo)衰老模型(Induced Senescence, IS)。2.Gas6延緩細(xì)胞的衰老過(guò)程分別使用多個(gè)濃度梯度和時(shí)間點(diǎn)的Gas6刺激細(xì)胞,通過(guò)Western blotting,發(fā)現(xiàn)使用250 ng/mL的Gas6連續(xù)刺激細(xì)胞36小時(shí),衰老相關(guān)分子指標(biāo)p16INK4a和p21Cipl較對(duì)照組明顯降低(P0.05,P0.001)3.Axl是介導(dǎo)Gas6發(fā)揮抗衰老作用的主要受體在給與細(xì)胞R428刺激后,無(wú)論是否給予Gas6干預(yù),p16INK4a和p21Cipl的蛋白表達(dá)水平以及SA-β-Gal染色率明顯高于未給予R428刺激組(P0.001,P0.001,P0.01)。而這兩組細(xì)胞的p16INK4a和p21Cipl的蛋白表達(dá)水平以及SA-β-Gal染色率水平卻無(wú)明顯差異。4.Gas6促進(jìn)細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)位并提高細(xì)胞的增殖水平在兩組衰老模型細(xì)胞中,再給予Gas6干預(yù)后,細(xì)胞均顯示出G1期的降低以及S期的增加(P0.05,P0.05),而年輕組細(xì)胞在給與Gas6干預(yù)后較其對(duì)照組尚無(wú)明顯改變。另外,在兩組衰老模型細(xì)胞中,在給與Gas6干預(yù)后,其增殖水平均較其對(duì)照組明顯增加(P0.05,P0.05)。5. PI3K/Akt/FoxO信號(hào)通路參與Gas6抗細(xì)胞衰老作用的過(guò)程在誘導(dǎo)衰老模型中,給予R428干預(yù)后,PI3K、p-Akt、p-FoxO3a以及cyclinE水平較對(duì)照組明顯降低(P0.01,P0.05,P0.01,P0.05),而p27kipl水平較對(duì)照組明顯增高(P0.01)；在復(fù)制衰老模型中,在給與細(xì)胞R428干預(yù)后,P13K、p-Akt、p-FoxO3a以及cyclin E水平較對(duì)照組明顯降低(P0.01,P0.05,P0.01,P0.05),而p27kipl水平較對(duì)照組明顯增高(P0.01)另外,我們使用PI3K的特異性阻斷劑LY294002干預(yù)后,檢測(cè)其下游通路的變化。在誘導(dǎo)衰老模型中,給予LY294002干預(yù)后,p-Akt、p-FoxO3a以及cyclinE水平較對(duì)照組明顯降低(P0.05,P0.05,P0.01),而p27kip1水平較對(duì)照組明顯增高(P0.01)；在復(fù)制衰老模型中,在給與細(xì)胞LY294002干預(yù)后,p-Akt、 p-FoxO3a以及cyclin E水平較對(duì)照組明顯降低(P0.01,P0.05,P0.01,P0.01),而p27kip1水平較對(duì)照組明顯增高(P0.05)6.FoxO是受Gas6調(diào)節(jié)的關(guān)鍵作用因子使用Fox03a-siRNA轉(zhuǎn)染MOVAS細(xì)胞后,p27kipl表達(dá)水平明顯增高(P0.01),而cyclin E表達(dá)水平明顯降低(P0.05)；另外,通過(guò)細(xì)胞周期分析,FoxO3a-siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞較對(duì)照組其G1期增高而S期降低(P0.01)結(jié)論1.Gas6延緩細(xì)胞的衰老過(guò)程；2.Axl是介導(dǎo)Gas6發(fā)揮抗衰老作用的主要受體；3.Gas6促進(jìn)細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)位并提高細(xì)胞的增殖水平；4. PI3K/Akt/FoxO信號(hào)通路參與Gas6延緩細(xì)胞衰老作用的過(guò)程；5. FoxO是受Gas6調(diào)節(jié)的關(guān)鍵作用因子。
【關(guān)鍵詞】：生長(zhǎng)停滯特異性蛋白-6 Gas6 Axl PI3K/Akt/FoxO信號(hào)通路 細(xì)胞衰老 細(xì)胞周期
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R339.38
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 符號(hào)說(shuō)明14-15
• 前言15-17
• 材料和方法17-35
• 結(jié)果35-39
• 討論39-43
• 創(chuàng)新點(diǎn)和限制性43-44
• 結(jié)論44-45
• 附圖45-58
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 致謝63-64
• 攻讀碩士學(xué)位期間的學(xué)術(shù)成果64-65
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表65-66
• 已發(fā)表論文Ⅰ66-70
• 已發(fā)表論文Ⅱ70-86
• 綜述86-93
• 參考文獻(xiàn)90-93

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本文編號(hào)：277635