【摘要】：在成功建立DSS誘導(dǎo)IBD小鼠模型,研究IL-35對于腸道免疫耐受的影響,并進一步探討其機制。第一部分初步分析DSS誘導(dǎo)IBD小鼠模型中IL-35的表達和意義目的:初步分析DSS誘導(dǎo)IBD小鼠模型中IL-35的表達和意義材料與方法:本課題采用Balb/c雌性小鼠5-6周齡,體重15-20g,將小鼠隨機分為實驗組20只(口服4%DSS),對照組10只(口服蒸餾水),實驗過程中每天記錄小鼠體重、皮毛、精神狀態(tài)及排便情況,7d后處死小鼠,收集血清用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA),檢測血清中IL-35的表達水平;分離腸道組織使用qRT-PCR和免疫組化、Western Blot對腸粘膜組織中的表達進行分析,結(jié)果采用統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果:血清IL-35的表達:IBD小鼠模型中血清IL-35的表達水平顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;腸道黏膜IL-35的表達:qRT-PCR檢測實驗組中EBi3和IL-12a表達水平高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,免疫組化提示IL-12a、STAT1腸道組織中高表達,做表達于腸道間質(zhì),Western Blot結(jié)果顯示IL-12a,STAT1模型組表達高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:IL-35在IBD小鼠模型血清中含量下降,在病變腸道組中表達升高,IL-35可能作為保護性因子,在IBD發(fā)病過程中起到一定作用,可能會成為IBD新的檢測和治療靶點。同時研究發(fā)現(xiàn)IL-35可能通過STAT1的信號通路參與IBD發(fā)病。本實驗研究較為局限,仍需進一步結(jié)合臨床病例,分子生物學(xué)實驗完善IL-35的分子機制。第二部分SHIP1對巨噬細胞系的增殖和凋亡的影響目的:通過調(diào)控miR-155與SHIP1的表達,分析SHIP1對RAW264.7和BMDM細胞系的增殖和凋亡,探討SHIP1在巨噬細胞增殖中的作用。材料與方法:1、首先通過靶標(biāo)分析軟件數(shù)據(jù)庫miRBase,PicTar和miRanda,結(jié)合文獻報道篩選出SHIP1基因突變相關(guān)miR-155的作用靶點;2、其次構(gòu)建用靶點雙熒光素酶報告載體,與miR-155mimics及miR-155inhibitor共轉(zhuǎn)染在RAW264.7和BMDM中,觀察miR-155是否能夠與靶基因3'-UTR區(qū)中預(yù)測的位點結(jié)合;3、實時熒光定量PCR(RT-PCR)和Western-blot(WB)檢測miR-155對SHIP1 mRNA和蛋白的表達的影響4、通過MTT實驗觀察調(diào)控miR-155和SHIP1蛋白的表達對細胞系增殖的影響,5、通過ELISA檢測轉(zhuǎn)染后RAW264.7和BMDM中炎性因子IL-6,TNF-α,IL-1β和IFN-γ的表達情況。結(jié)果:1、利用生物軟件預(yù)測到miR-155靶基因位點。2、通過構(gòu)建含有miR-155靶基因位點的雙熒光素酶報告載體,證實了miR-155能與SHIP1上靶基因位點結(jié)合,并且可以抑制SHIP1mRNA和蛋白的表達。3、MTT實驗分析發(fā)現(xiàn)過表達miR-155促進細胞增殖,上調(diào)SHIP1蛋白表達抑制細胞增殖,比較有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)4、ELISA分析過表達miR-155誘導(dǎo)IL-6,TNF-α,IL-1β和IFN-γ,上調(diào)SHIP1 表達可以抑制IL-6,TNF-α,IL-1β和IFN-y過表達(p0.05)結(jié)論:調(diào)控SHIP1的表達可以緩解miR-155對于巨噬細胞活化及源性炎性因子表達的影響。第三部分IL-35對IBD小鼠模型巨噬細胞極化的影響目的:初步分析IL-35對IBD小鼠模型中巨噬細胞極化的影響及機制初步研究材料與方法:用Balb/c雌性小鼠5-6周齡,體重15-20g共30只,設(shè)立對照組、模型組(口服4%DSS 7d)、IL-35干預(yù)組(口服4%DSS 7d,第2d至第5d,腹腔注射2ug/只),每組10只。7d后處死小鼠,留取血清和腸道組織,進行HE染色觀察各組結(jié)腸組織病理形態(tài)變化;流式細胞技術(shù)檢測各組M2型巨噬細胞的數(shù)量變化;免疫組化檢測各組腸道組織SHIP1的表達;RT-PCR檢測各組腸道組織中SHIPlmRNA的變化和Western-blot檢測各組腸道組織中SHIP1蛋白的表達情況。同時檢測對照組、模型組、IL-35干預(yù)組中巨噬細胞極化因子的表達情況。結(jié)果:對照組、DSS模型組、IL-35干預(yù)組模型構(gòu)建成功;IL-35干預(yù)組結(jié)腸炎較對照組和模型組損傷程度減輕;IL-35干預(yù)組較模型組M2型巨噬細胞數(shù)量增加,提高M2/M1比值;IL-35干預(yù)組較模型組SHIP1蛋白的表達增加。IL-35干預(yù)組較模型組M2型極化相關(guān)因子的表達增加。結(jié)論:IL-35能緩解DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠模型,可能通過調(diào)控SHIP的表達,促進M2巨型細胞極化有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R574;R-332
【圖文】：

的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包潰瘍性結(jié)腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ邋ｃｏｌｉｔｉｓ，ＵＣ）逡逑和克羅恩病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ邋ｄｉｓｅａｓｅ，邋ＣＤ），發(fā)病機制目前還不清楚［１］。ＩＢＤ主要包括逡逑潰v 性結(jié)腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ邋ｃｏｌｉｔｉｓ，ＵＣ）和克羅恩病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ邋ｄｉｓｅａｓｅ，邋ＣＤ），逡逑具有反復(fù)發(fā)作的特點，嚴(yán)重可導(dǎo)致腸道梗阻、穿孔。流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn)北美地區(qū)逡逑ＵＣ的患病率為３７．邋５－２３８／１０萬人，ＣＤ的患病率為４－２０１／１０萬人，而每年的新發(fā)病例逡逑分別為２－１５／１０萬人和４－１０／１０萬人［１］。我國１９９３年６月在全國慢性非感染性腸道逡逑疾病學(xué)術(shù)研究會，提出了ＵＣ和ＣＤ較為詳細的診斷標(biāo)準(zhǔn)和療效判斷標(biāo)準(zhǔn)，并在２００７逡逑年和２０１２年分別提出ＩＢＤ的規(guī)范診治建議［２］．近年來我國ＩＢＤ的發(fā)病率迅速增加；逡逑過去十年中，ＩＢＤ病例數(shù)增加約２．邋５倍；其中ＣＤ患者增加了邋１５．邋７倍［３］。逡逑

圖２輔助性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ｈｅｌｐ邋Ｔｃｅｌｌ，邋Ｔｈ）亞群。根據(jù)Ｔｈ功能和分泌的細胞因子不同，可分逡逑為Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｈｌ７、Ｔｒｅｇ細胞亞群，分泌特征性炎性因子逡逑ＩＬ－３５是２００７年由ＶｉｇｎａｌｉＤＡ等發(fā)現(xiàn)并命名的新型細胞因子，ＩＬ－３５是逡逑ＩＬ－１２家族的最新成員，由ＥＢＩ３（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ邋ｖｉｒｕｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｇｅｎｅ邋３）及Ｐ３５亞基組成的逡逑異源性二聚體［９］。在第１３屆免疫學(xué)國際會議上首次命名為ＩＬ－３５，但與其他的ＩＬ－１２逡逑家族成員不同的是，ＩＬ－３５主要由ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調(diào)節(jié)性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ邋Ｔ邋ｃｅｌｌｓ，逡逑Ｔｒｅｇ）產(chǎn)生細胞因子，被認為一種產(chǎn)生于Ｔｒｅｇｓ且為Ｔｒｅｇｓ發(fā)揮最大抑制功能所依逡逑賴的新細胞因子，抑制Ｔ細胞的功能，導(dǎo)致免疫耐受的形成。研宄發(fā)現(xiàn)ＥＢＩ３，作逡逑

？？．逡逑邐南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文逡逑（如ＨＣＶ）、自身免疫病和移植排斥反應(yīng)的靶點。目前最新一項臨床研宄證實：ＩＢＤ逡逑患者ＩＬ－３５表達增加與ＩＢＤ炎癥反應(yīng)下調(diào)具有相關(guān)性［１１＇１２］邋，邋ＩＬ－３５可能會成為治逡逑療ＩＢＤ的重要分子靶點之一［１３１，邋ＩＬ－３５是否可有誘導(dǎo)免疫耐受，緩解ＩＢＤ免疫紊亂逡逑目前還不清楚。逡逑ＩＬ－３５

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2771269