【摘要】：在成功建立DSS誘導(dǎo)IBD小鼠模型,研究IL-35對(duì)于腸道免疫耐受的影響,并進(jìn)一步探討其機(jī)制。第一部分初步分析DSS誘導(dǎo)IBD小鼠模型中IL-35的表達(dá)和意義目的:初步分析DSS誘導(dǎo)IBD小鼠模型中IL-35的表達(dá)和意義材料與方法:本課題采用Balb/c雌性小鼠5-6周齡,體重15-20g,將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組20只(口服4%DSS),對(duì)照組10只(口服蒸餾水),實(shí)驗(yàn)過程中每天記錄小鼠體重、皮毛、精神狀態(tài)及排便情況,7d后處死小鼠,收集血清用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),檢測(cè)血清中IL-35的表達(dá)水平;分離腸道組織使用qRT-PCR和免疫組化、Western Blot對(duì)腸粘膜組織中的表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:血清IL-35的表達(dá):IBD小鼠模型中血清IL-35的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;腸道黏膜IL-35的表達(dá):qRT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組中EBi3和IL-12a表達(dá)水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,免疫組化提示IL-12a、STAT1腸道組織中高表達(dá),做表達(dá)于腸道間質(zhì),Western Blot結(jié)果顯示IL-12a,STAT1模型組表達(dá)高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:IL-35在IBD小鼠模型血清中含量下降,在病變腸道組中表達(dá)升高,IL-35可能作為保護(hù)性因子,在IBD發(fā)病過程中起到一定作用,可能會(huì)成為IBD新的檢測(cè)和治療靶點(diǎn)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)IL-35可能通過STAT1的信號(hào)通路參與IBD發(fā)病。本實(shí)驗(yàn)研究較為局限,仍需進(jìn)一步結(jié)合臨床病例,分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)完善IL-35的分子機(jī)制。第二部分SHIP1對(duì)巨噬細(xì)胞系的增殖和凋亡的影響目的:通過調(diào)控miR-155與SHIP1的表達(dá),分析SHIP1對(duì)RAW264.7和BMDM細(xì)胞系的增殖和凋亡,探討SHIP1在巨噬細(xì)胞增殖中的作用。材料與方法:1、首先通過靶標(biāo)分析軟件數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase,PicTar和miRanda,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道篩選出SHIP1基因突變相關(guān)miR-155的作用靶點(diǎn);2、其次構(gòu)建用靶點(diǎn)雙熒光素酶報(bào)告載體,與miR-155mimics及miR-155inhibitor共轉(zhuǎn)染在RAW264.7和BMDM中,觀察miR-155是否能夠與靶基因3'-UTR區(qū)中預(yù)測(cè)的位點(diǎn)結(jié)合;3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)和Western-blot(WB)檢測(cè)miR-155對(duì)SHIP1 mRNA和蛋白的表達(dá)的影響4、通過MTT實(shí)驗(yàn)觀察調(diào)控miR-155和SHIP1蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞系增殖的影響,5、通過ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染后RAW264.7和BMDM中炎性因子IL-6,TNF-α,IL-1β和IFN-γ的表達(dá)情況。結(jié)果:1、利用生物軟件預(yù)測(cè)到miR-155靶基因位點(diǎn)。2、通過構(gòu)建含有miR-155靶基因位點(diǎn)的雙熒光素酶報(bào)告載體,證實(shí)了miR-155能與SHIP1上靶基因位點(diǎn)結(jié)合,并且可以抑制SHIP1mRNA和蛋白的表達(dá)。3、MTT實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-155促進(jìn)細(xì)胞增殖,上調(diào)SHIP1蛋白表達(dá)抑制細(xì)胞增殖,比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)4、ELISA分析過表達(dá)miR-155誘導(dǎo)IL-6,TNF-α,IL-1β和IFN-γ,上調(diào)SHIP1 表達(dá)可以抑制IL-6,TNF-α,IL-1β和IFN-y過表達(dá)(p0.05)結(jié)論:調(diào)控SHIP1的表達(dá)可以緩解miR-155對(duì)于巨噬細(xì)胞活化及源性炎性因子表達(dá)的影響。第三部分IL-35對(duì)IBD小鼠模型巨噬細(xì)胞極化的影響目的:初步分析IL-35對(duì)IBD小鼠模型中巨噬細(xì)胞極化的影響及機(jī)制初步研究材料與方法:用Balb/c雌性小鼠5-6周齡,體重15-20g共30只,設(shè)立對(duì)照組、模型組(口服4%DSS 7d)、IL-35干預(yù)組(口服4%DSS 7d,第2d至第5d,腹腔注射2ug/只),每組10只。7d后處死小鼠,留取血清和腸道組織,進(jìn)行HE染色觀察各組結(jié)腸組織病理形態(tài)變化;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化;免疫組化檢測(cè)各組腸道組織SHIP1的表達(dá);RT-PCR檢測(cè)各組腸道組織中SHIPlmRNA的變化和Western-blot檢測(cè)各組腸道組織中SHIP1蛋白的表達(dá)情況。同時(shí)檢測(cè)對(duì)照組、模型組、IL-35干預(yù)組中巨噬細(xì)胞極化因子的表達(dá)情況。結(jié)果:對(duì)照組、DSS模型組、IL-35干預(yù)組模型構(gòu)建成功;IL-35干預(yù)組結(jié)腸炎較對(duì)照組和模型組損傷程度減輕;IL-35干預(yù)組較模型組M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量增加,提高M(jìn)2/M1比值;IL-35干預(yù)組較模型組SHIP1蛋白的表達(dá)增加。IL-35干預(yù)組較模型組M2型極化相關(guān)因子的表達(dá)增加。結(jié)論:IL-35能緩解DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠模型,可能通過調(diào)控SHIP的表達(dá),促進(jìn)M2巨型細(xì)胞極化有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R574;R-332
【圖文】：

的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包潰瘍性結(jié)腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ邋ｃｏｌｉｔｉｓ，ＵＣ）逡逑和克羅恩�。ǎ茫颍铮瑁睢箦澹洌椋螅澹幔螅�，邋ＣＤ），發(fā)病機(jī)制目前還不清楚［１］。ＩＢＤ主要包括逡逑潰v 性結(jié)腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ邋ｃｏｌｉｔｉｓ，ＵＣ）和克羅恩�。ǎ茫颍铮瑁睢箦澹洌椋螅澹幔螅�，邋ＣＤ），逡逑具有反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，嚴(yán)重可導(dǎo)致腸道梗阻、穿孔。流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn)北美地區(qū)逡逑ＵＣ的患病率為３７．邋５－２３８／１０萬人，ＣＤ的患病率為４－２０１／１０萬人，而每年的新發(fā)病例逡逑分別為２－１５／１０萬人和４－１０／１０萬人［１］。我國(guó)１９９３年６月在全國(guó)慢性非感染性腸道逡逑疾病學(xué)術(shù)研究會(huì)，提出了ＵＣ和ＣＤ較為詳細(xì)的診斷標(biāo)準(zhǔn)和療效判斷標(biāo)準(zhǔn)，并在２００７逡逑年和２０１２年分別提出ＩＢＤ的規(guī)范診治建議［２］．近年來我國(guó)ＩＢＤ的發(fā)病率迅速增加；逡逑過去十年中，ＩＢＤ病例數(shù)增加約２．邋５倍；其中ＣＤ患者增加了邋１５．邋７倍［３］。逡逑

圖２輔助性ＣＤ４＋Ｔ細(xì)胞（ｈｅｌｐ邋Ｔｃｅｌｌ，邋Ｔｈ）亞群。根據(jù)Ｔｈ功能和分泌的細(xì)胞因子不同，可分逡逑為Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｈｌ７、Ｔｒｅｇ細(xì)胞亞群，分泌特征性炎性因子逡逑ＩＬ－３５是２００７年由ＶｉｇｎａｌｉＤＡ等發(fā)現(xiàn)并命名的新型細(xì)胞因子，ＩＬ－３５是逡逑ＩＬ－１２家族的最新成員，由ＥＢＩ３（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ邋ｖｉｒｕｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｇｅｎｅ邋３）及Ｐ３５亞基組成的逡逑異源性二聚體［９］。在第１３屆免疫學(xué)國(guó)際會(huì)議上首次命名為ＩＬ－３５，但與其他的ＩＬ－１２逡逑家族成員不同的是，ＩＬ－３５主要由ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調(diào)節(jié)性Ｔ細(xì)胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ邋Ｔ邋ｃｅｌｌｓ，逡逑Ｔｒｅｇ）產(chǎn)生細(xì)胞因子，被認(rèn)為一種產(chǎn)生于Ｔｒｅｇｓ且為Ｔｒｅｇｓ發(fā)揮最大抑制功能所依逡逑賴的新細(xì)胞因子，抑制Ｔ細(xì)胞的功能，導(dǎo)致免疫耐受的形成。研宄發(fā)現(xiàn)ＥＢＩ３，作逡逑

？？．逡逑邐南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文逡逑（如ＨＣＶ）、自身免疫病和移植排斥反應(yīng)的靶點(diǎn)。目前最新一項(xiàng)臨床研宄證實(shí)：ＩＢＤ逡逑患者ＩＬ－３５表達(dá)增加與ＩＢＤ炎癥反應(yīng)下調(diào)具有相關(guān)性［１１＇１２］邋，邋ＩＬ－３５可能會(huì)成為治逡逑療ＩＢＤ的重要分子靶點(diǎn)之一［１３１，邋ＩＬ－３５是否可有誘導(dǎo)免疫耐受，緩解ＩＢＤ免疫紊亂逡逑目前還不清楚。逡逑ＩＬ－３５

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號(hào)：2771269