發(fā)布時(shí)間：2020-07-26 18:18

【摘要】：人副流感病毒3型(Human Parainfluenza Virus Type3, HPIV3)是引起嬰幼幾急性下呼吸道疾病如支氣管炎、肺炎等的主要病原之一。它與人們所熟知的呼吸道合胞病毒、狂犬病毒、麻疹病毒等一樣,都屬于不分節(jié)負(fù)鏈RNA病毒。目前,對(duì)于HPIV3還沒(méi)有有效的抗病毒藥物和疫苗。因此,澄清HPIV3的復(fù)制轉(zhuǎn)錄的機(jī)制將為下一步研制有效的抗病毒藥物和疫苗提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 病毒的核心蛋白(Nucleoprotein, N)包裹病毒的基因組形成N-RNA模板,磷酸蛋白(Phosphoprotein, P)則是病毒RNA聚合酶輔因子。它們與聚合酶的大蛋白(Large protein, L)起組成病毒RNA聚合酶復(fù)合體,在病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程中起著非常重要的作用,也因此N蛋白和P蛋白之間的相互作用一直是HPIV3的復(fù)制轉(zhuǎn)錄機(jī)制研究的熱點(diǎn)。而之前的研究表明,N蛋白氨基端的氨基酸是它完成自身寡聚化以及與RNA結(jié)合形成N-RNA模板的關(guān)鍵區(qū)域,而它的羧基端則是N-RNA模板與P蛋白結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。通過(guò)對(duì)P蛋白的序列及結(jié)構(gòu)分析,它與N。形式的N蛋白相互作用的區(qū)域位于P蛋白氨基端的40個(gè)氨基酸內(nèi),與N-RNA相互作用的區(qū)域位于其羧基端的20個(gè)氨基酸內(nèi)。 盡管近幾年對(duì)N蛋白與P蛋白相互作用的研究已經(jīng)很多了,也得到了很多與復(fù)制轉(zhuǎn)錄機(jī)制有關(guān)的研究結(jié)果,但關(guān)于它們之間的相互作用仍有很多問(wèn)題有待進(jìn)一步的研究和確認(rèn),例如N蛋白上和P蛋白的相互作用的具體位點(diǎn),N0與P蛋白、N-RNA與P蛋白相互作用的聯(lián)系和區(qū)別等。為了尋找N蛋白上調(diào)節(jié)N蛋白和P蛋白的相互作用的具體何點(diǎn),并進(jìn)一步弄清楚N蛋白與P蛋白相互作用的具體機(jī)制,我們利用HPIV3的微基因組系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)了N蛋白上的一個(gè)關(guān)鍵氨基酸Leu478,這個(gè)氨基酸位點(diǎn)的丙氨酸掃描突變體(NL478A)喪失了RNA合成的能力,并通過(guò)免疫共沉淀的方法,證明了這個(gè)位點(diǎn)的氨基酸突變喪失了與P蛋白相互作用的能力。為了進(jìn)一步的區(qū)分N0與P蛋白、N-RNA與P蛋白相互作用的差異,我們利用經(jīng)CsCl密度梯度離心純化的N-RNA與P蛋白及其突變體在體外進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)這個(gè)位點(diǎn)的氨基酸突變體只是喪失了N-RNA與P蛋白的相互作用的能力,對(duì)于N0-P的相互作用則沒(méi)有影響。同時(shí),我們檢測(cè)它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的定位情況,發(fā)現(xiàn)野生型N蛋白與P蛋白可以形成病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的中心---包涵體,而N蛋白突變體則不能。隨后,我們將這個(gè)突變引入到病毒基因組中利用反向遺傳學(xué)構(gòu)建重組病毒,但經(jīng)過(guò)多次重復(fù)均不能得到帶有NL478A突變的重組病毒。通過(guò)野生型N蛋白與P蛋白突變體共定位的研究,發(fā)現(xiàn)N0以及N-RNA與P蛋白的相互作用對(duì)于包涵體形成都是必不可少的。而且通過(guò)P蛋白氨基端缺失突變體與羧基端缺失突變體在包涵體及RNA合成方面的互補(bǔ)研究發(fā)現(xiàn)P蛋白是一個(gè)多功能的蛋白,它存在多個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域調(diào)控N蛋白和P蛋白的相互作用,并調(diào)節(jié)包涵體的形成。 我們的研究首次對(duì)副粘RNA病毒N蛋白和P蛋白的相互作用的位點(diǎn)以及包涵體形成區(qū)域進(jìn)行了精確定位,為抗病毒研究藥物和疫苗的研發(fā)提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),對(duì)其它負(fù)鏈RNA病毒N蛋白和P蛋白功能研究也具有一定的啟示意義。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R373.13
【圖文】：

圖1.丨HPIV3病毒粒子的電鏡照片及模式圖(Bukreyev，Marzi et al. 2009, Moscona 2005)。2 HPIV3的生物學(xué)特性2.1 HPIV3的基因結(jié)構(gòu)HPIV3的基因組是由一條被N蛋白所包裹的單股負(fù)義、不分節(jié)的RNA成的。它含有15462個(gè)核苷酸，在數(shù)量上正好是6的倍數(shù)，HPIV3的基因組遵循負(fù)鏈RNA病毒普遍存在的“6的倍數(shù)”的原則(Calain and Roux 1993)。2

圖1.2HPIV3基因結(jié)構(gòu)示意圖。如圖1.2所示，在HPIV3基因組的兩端各有一段在病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程起到類(lèi)似于啟動(dòng)子作用的序列：位于3’由55 nt組成的前導(dǎo)序列（Leader, Le)和位于5’端由44 nt組成的拖尾序列（Trailer, Tr)。在這兩段序列之間，HPIV3的各基因的編碼序列依次排列，每?jī)蓚�(gè)基因之間通過(guò)一個(gè)基因間隔區(qū)域（Genie Junction，GJ)分開(kāi)。這個(gè)基因間隔區(qū)域則由三個(gè)部分組成：基因起始序列（Gene start，GS),基因間隔序列（Gene interval, GI)和基因結(jié)束序列（Gene end，GE) (Durbin, Siewetal. 1997, Mao, Thakuretal. 2008)。在GS中存在一些比較保守的基因序列，具體表現(xiàn)為3’-UCCUnnUUUC-5’，其中nn表示此處的基因序列可以是任意的不保守核節(jié)^酸序列。這樣的一段保守的基因序列可能與聚合酶的識(shí)別及進(jìn)入有關(guān)，也可能與病毒 mRNA 的加帽有關(guān)(Hinzman, Barr et al. 2002)。在病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的時(shí)候，從基因組的3’^u始在病毒自身RNA聚合酶…L蛋白的作用下經(jīng)過(guò)一系列的啟動(dòng)-停止的方式先合成52nt的前導(dǎo)序列（Leader，Le),

內(nèi)的部分發(fā)生相互作用，參與病毒的組裝和出芽過(guò)程。4) F蛋白：通過(guò)自身結(jié)構(gòu)的改變，介導(dǎo)病毒對(duì)細(xì)胞的入侵。5)HN蛋白：可以與細(xì)胞表面的唾液酸受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒的吸附，同時(shí)還具有神經(jīng)氨酸酶活性參與病毒的釋放過(guò)程，此外它還具有激活F蛋白的能力(Lawrence, Borg et al. 2004)。6) L蛋A:病毒聚合酶的主要組成部分，也是RNP的重要組成成分之一。7) C、D 和 V:參與病毒與細(xì)胞的互作(Malur, Chattopadhyay et al. 2005)，對(duì)轉(zhuǎn)錄復(fù)制也起到一定的調(diào)節(jié)作用(Durbin, McAuliffe et al. 1999)。其中C蛋內(nèi)就被報(bào)道可以與病毒的L蛋A相結(jié)合，抑制病毒的復(fù)制過(guò)程(Mao, Chattopadhyay et al.2009)。2.3 HPIV3的生活史HPIV3感染細(xì)胞后在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中完成0身的復(fù)制和擴(kuò)增，具體過(guò)程如圖1.3所示。

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