【摘要】：前言 干細胞指的是同時具有自我更新能力和多向分化潛能的一類細胞，干細胞從來源可分為胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESC)和不同組織來源的成體干細胞(adultstem cells, ASC)。其中ESC來自于囊胚的內(nèi)細胞團,先后從小鼠、靈長目動物及人中分離得到。ESC具有近乎無限的自我更新和分化能力，可以產(chǎn)生三個胚層方向的終末分化細胞，進而形成各種器官包括中、內(nèi)和外胚層器官。ASC研究最早最深入的是造血干細胞(hematopoietic stem cells, HSC)。之后又陸續(xù)報道了神經(jīng)干細胞(neural stemcells, NSC)、間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells)、以及其他來源的干細胞種類，如腸干細胞，表皮干細胞，肝干細胞（也稱卵圓細胞）等。在組織生長與再生過程中，干細胞會不斷的改變其性狀：在胚胎發(fā)育期，干細胞快速分裂實現(xiàn)迅速生長；到青春期后，個體生長變慢或停止，而大部分干細胞也進入休眠，僅為維持組織自穩(wěn)態(tài)而產(chǎn)生分裂增殖；到老年后，干細胞表達更多的抑癌性的管家基因，從而降低癌癥發(fā)生率，但同時也降低了再生能力，即細胞發(fā)生衰老，干細胞內(nèi)部的這些改變一般通過常染色體基因的變化來體現(xiàn)。 目前已知的衰老機制為，組成細胞的各種理化物質(zhì)在機體運動中不斷受到內(nèi)外環(huán)境的影響而發(fā)生損傷，造成功能退行性下降。細胞衰老是細胞在經(jīng)歷了增殖、分化過程后，不可避免出現(xiàn)的，各細胞器在內(nèi)外環(huán)境的損傷因素下，因缺乏完善的修復(fù)，使“差錯”積累，導(dǎo)致細胞衰老，是機體發(fā)育過程中的一種正常生命現(xiàn)象。其特征包括：細胞內(nèi)酶的活性降低；色素積累；細胞內(nèi)呼吸速度減慢，胞核增大，核膜內(nèi)折，染色質(zhì)收縮，顏色加深。線粒體數(shù)量減少，體積增大；胞膜通透性功能改變，使物質(zhì)運輸功能降低等。分子水平的變化主要有DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)抑制，RNA含量降低，蛋白翻譯和合成減少，以及細胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸等的氧化現(xiàn)象等。在衰老形成各種原因中，年齡與衰老無疑具有最大的相關(guān)性，并可引起與細胞衰老相關(guān)的多種疾病，如阿爾茲海默（老年性癡呆）、帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)、關(guān)節(jié)退行性改變等等各種疾病。 PD是一種神經(jīng)退行性疾病，在55歲以上人群中發(fā)病率高達1%以上，在中外流行病學(xué)分析中都有報道。已知帕金森的發(fā)病是由于中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元受損引起，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(Dopamine, DA)的減少，從而引起相關(guān)神經(jīng)傳導(dǎo)異常，而導(dǎo)致一系列的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，包括靜止性震顫，自主運動等。目前PD的常規(guī)治療方法仍然是藥物療法，常用左旋多巴等藥物以替代多巴胺，但會導(dǎo)致一系列的副作用。與此同時，PD作為一種由單一細胞種類損壞引起的疾病，干細胞治療是非常值得期待的療法。 目前認為可能用于PD治療的干細胞來源包括ESC，NSC，誘導(dǎo)性多能干細胞(induced pluripotent stem cells, IPS)，MSC等。ESC體外向DA神經(jīng)元分化已有報道。但是胚胎干細胞一般是來自于異源性組織的細胞，有免疫排斥的風(fēng)險。近來有成體細胞核移植獲得的ESC，即SCNT-ES，可避免免疫排斥反應(yīng)，但在體內(nèi)有成畸胎瘤的可能，且ESC的倫理學(xué)爭議較多。NSC，一般來自于胚腦神經(jīng)組織，體外也可分化為腦組織中幾乎所有類型的神經(jīng)元，包括DA神經(jīng)元。但是NSC分化潛能比ESC較弱，定向分化效率也較低，同時來源有限，且有倫理學(xué)爭議。IPS的發(fā)現(xiàn)，使干細胞的理念進一步更新，IPS具有與胚胎干細胞相類似的全能性，且細胞可來自于自體，體外分化為DA神經(jīng)元也有報道，但IPS需要導(dǎo)入基因，安全性仍未明確。所以目前仍然以自體來源的尤其是骨髓來源的干細胞最為方便及安全。但是對于PD老年人群，自體骨髓干細胞是否存在，效果如何，仍未可知。 本課題設(shè)計了老年人來源的骨髓多能祖細胞（clonal older-derived multipotentprogenitor cells, coMAPC）的分離培養(yǎng)實驗，尋求合適的培養(yǎng)體系，以驗證成體來源的骨髓干細胞的多能性及干細胞特征。通過克隆化培養(yǎng)，獲得單個干細胞來源的coMAPC細胞系，使coMAPC細胞更為純化。coMAPC細胞表達多種干細胞多能性標(biāo)記物Oct4，Sox2，Nanog，克隆化培養(yǎng)也使coMAPC保持更好的分化多能性和自我更新性。全基因組芯片分析證實coMAPC表達更低的衰老基因，證實了老年人骨髓中依然存在多能性依然保持較好的干細胞。采用特異性的二步法定向誘導(dǎo)coMAPC，即RA+bFGF誘導(dǎo)7天和Shh+neuralbasal誘導(dǎo)14天后，可定向誘導(dǎo)coMAPC分化為具有DA神經(jīng)元樣特征的細胞，并可分泌產(chǎn)生DA神經(jīng)遞質(zhì)的功能性細胞。 Part：老年骨髓多能干細胞多能性干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定 方法：(1) coMAPC細胞的原代分離和培養(yǎng)：骨髓組織來源于臨床志愿者捐獻，采集年齡主要位于50-70歲區(qū)間，coMAPC培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基含59%DMEM，39%MCDB，1×ITS，1×HSA，1×LA，10-9M Dex，2%FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)液，添加劑包括10ng/mL EGF，10ng/mLPDGF-BB。分離方法包括淋巴細胞分離液密度梯度離心法和全骨髓貼壁法兩種，之后極限稀釋后進行單克隆化培養(yǎng)獲得coMAPC細胞：（2）coMAPC細胞的生長動力學(xué)測定：細胞計數(shù)情況繪制生長曲線；并計算得出細胞倍增時間，對細胞生長動力學(xué)進行全面整體評估。（3）細胞染色體標(biāo)本的制備以及染色體數(shù)目分析：秋水仙素處理增殖期細胞，觀察記錄分散良好的分裂相。（4）免疫熒光細胞化學(xué)檢測不同傳代次數(shù)的coMAPC細胞分子表達。FCM檢測不同傳代次數(shù)后的coMAPC細胞，包括鑒定coMAPC細胞的表面分子標(biāo)記物特征和細胞周期測定。（5）cMAPC的三胚層多向誘導(dǎo)分化：成脂、成軟骨、成骨、成血管內(nèi)皮、成肝細胞、成神經(jīng)誘導(dǎo)后，分別用油紅O染液、阿爾辛藍染色、茜素紅、CD31、vWF、Albumin和GFAP、Nestin、TAU、Tuj1等標(biāo)記染色。（6）GFP標(biāo)記的慢病毒Lentivirus感染標(biāo)記coMAPC細胞：準(zhǔn)備預(yù)先包裝成功的缺陷病毒液，以及polybrene，按照相應(yīng)濃度加入細胞培養(yǎng)液中。 結(jié)果：（1）對不同年齡段人群來源的骨髓多能祖細胞進行了多種方法的分離培養(yǎng)，coMAPC細胞可從幾乎所有年齡段的成體骨髓組織中分離獲得。（2）表面標(biāo)記物檢測表明，coMAPC細胞表達CD29、CD44、CD90、CD105、CD106等，但不表達CD34、CD45等造血系統(tǒng)來源標(biāo)記。同時人類白細胞抗原HLA-1經(jīng)流式細胞檢測也為陰性。流式細胞儀檢測細胞周期也表明，在目前的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件下，coMAPC的穩(wěn)定增殖在前10次傳代內(nèi)基本保持穩(wěn)定。細胞核型二倍體比例均為100%，同時細胞周期中處于靜止期或增殖準(zhǔn)備期（G0/G1期）的比例均在80%以上，凋亡細胞的比例為5%以下。上述結(jié)果表明coMAPC體外分離培養(yǎng)后可以獲得較穩(wěn)定的自我更新能力。（3）coMAPC表達一般中胚層來源的細胞骨架蛋白Vimentin，αSMA，coMAPC依然保留了中胚層來源的相關(guān)特征分子。而CD31、SSEA-1和MHC-I表達為陰性。在細胞生長曲線繪制中，可以看出coMAPC經(jīng)歷約3d左右的對數(shù)生長期后，進入增殖平臺期。分時計數(shù)可算得coMAPC細胞倍增時間約為30h。（4）慢病毒感染coMAPC細胞同樣具有較高感染效率，且對細胞生長狀態(tài)未見明顯影響。 結(jié)論：coMAPC可從不同年齡段人群的骨髓中分離獲得，且使用淋巴細胞分離液密度梯度離心法可更快更有效獲得較為純化的coMAPC細胞，現(xiàn)有培養(yǎng)體系和克隆化得到的coMAPC細胞，可以較為穩(wěn)定的擴增，維持其自我更新能力。coMAPC表達Oct4、Sox2、Nanog等多能性基因，具有多向分化能力，coMAPC細胞的增殖曲線和細胞周期檢測結(jié)果說明，對于長期傳代培養(yǎng)以及骨髓標(biāo)本來源較年長的體外培養(yǎng)細胞，其自我更新能力與穩(wěn)定性不可避免會隨著培養(yǎng)時間和傳代次數(shù)增多而下降。慢病毒感染coMAPC細胞同樣具有較高感染效率，且對細胞生長狀態(tài)未見明顯影響。 Part II：單克隆化的老年骨髓多能干細胞干性及特性分析 方法：（1）coMAPC全基因組表達譜芯片分析比較。抽提coMAPC細胞的totalRNA。（2）total RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA文庫后，以cDNA為模板合成帶有生物素biotin標(biāo)記的antisense RNA(aRNA)。（3）aRNA進行片段化處理后，同Human GenomeU133Plus2.0Array芯片進行雜交。（4）使用Affymetrix公司的GeneChip2Scanner30007G掃描儀進行芯片掃描解讀并與數(shù)據(jù)庫中信息分析比較差異表達基因。（5）coMAPC細胞衰老基因的鑒定及比較：PCR法進行細胞周期調(diào)控分子p16, p19, p21, hTERT以及p53的mRNA檢測，WB檢測p16, p19, p21, hTERT以及p53的蛋白水平表達。（6）coMAPC克隆間多能性基因的表達比較，RNA水平比較基因為Oct4、Sox2、 Nanog、Oct4A、Oct4B。蛋白檢測指標(biāo)為Oct4、Sox2、 Nanog。 結(jié)果：克隆化培養(yǎng)后，coMAPC細胞成為真正意義上的單個細胞來源的高純度細胞群。cMAPC細胞的多能性基因Oct4、Sox2、Nanog等進行了RNA水平的比較分析。挑選出表達較高較穩(wěn)定的D8株coMAPC細胞克隆進行擴增及后續(xù)檢測。IF檢測也證實D8可穩(wěn)定表達多能性基因并位于細胞核內(nèi)。對coMAPC細胞的全基因組芯片檢測結(jié)果進行分析，并與數(shù)據(jù)庫中MSC及ESC基因表達譜進行比較，證實coMAPC細胞周期相關(guān)基因存在差異化表達。PCR與WB檢測結(jié)果表明p16，p19，P21和P53等衰老相關(guān)基因在coMAPC細胞內(nèi)總體表達水平有所降低。而細胞增殖能力相關(guān)分子，hTERT的表達，在細胞總體水平有所升高。 結(jié)論：總結(jié)這一部分實驗，我們認為，coMAPC來源與自體骨髓，這種細胞在老年人骨髓中依然存在，而多能性分子的表達和三胚層方向多向誘導(dǎo)分化的陽性結(jié)果，提示老年人來源的coMAPC細胞，同樣具有多能性分子的表達和穩(wěn)定的自我更新能力。全基因組芯片檢測比較coMAPC與MSC及ESC證實了coMAPC具有相對年輕化的基因表達特征，GO分析與Pathway分析提示細胞周期相關(guān)調(diào)節(jié)通路蛋白差異顯著。p16，p19，P21和P53等衰老相關(guān)基因低表達表明克隆化培養(yǎng)方式可以篩選出具有年輕化性質(zhì)的coMAPC細胞。coMAPC可以作為老年人細胞治療的種子細胞。 PART III：老年骨髓多能干細胞(coMAPC)向多巴胺能神經(jīng)元的定向分化 方法：（1）二期誘導(dǎo)法誘導(dǎo)coMAPC細胞定向分化，第一期為coMAPC的神經(jīng)外胚層誘導(dǎo)：取生長狀態(tài)良好的細胞，消化獲得單細胞懸液。細胞接種至FN處理后的6孔板爬片上，接種密度為3000個/cm2，基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF（50ng/ml）+RA（10-8M）誘導(dǎo)7-10天。（2）第二階段為多巴胺能神經(jīng)元分階段定向分化：棄掉一期誘導(dǎo)培養(yǎng)液，PBS清洗2次后，加入二期誘導(dǎo)培養(yǎng)液neuralbasal（購自Gibco公司）+SHH（RD250ng/ml）+Nurr1（RD200ng/ml）。每3天半量換液一次。維持14天。（3）免疫熒光檢測coMAPC細胞定向分化過程中的神經(jīng)標(biāo)記物Tuj1，TH，En1，Ptx3，Nurr1，ALDH1A1，DAT，VMAT等（4）FCM檢測TH與Tuj1雙陽性比例，比較二期誘導(dǎo)法與已知誘導(dǎo)方法的分化效率。（5）coMAPC分化為多巴胺能神經(jīng)元的功能鑒定。功能鑒定主要檢測DA的分泌功能。使用酶聯(lián)免疫反應(yīng)吸附試驗Elisa試劑盒完成。 結(jié)果：對克隆化培養(yǎng)的老年多能成體祖細胞coMAPC細胞進行向多巴胺能神經(jīng)元的定向誘導(dǎo)：在使用多種誘導(dǎo)因子和條件的情況下，通過分兩步誘導(dǎo)的方法，成功的獲得了具有多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)記物且可產(chǎn)生特定物質(zhì)TH的神經(jīng)元樣細胞。第一階段，成功獲得了類神經(jīng)干細胞，可出現(xiàn)神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)。分化后細胞可表達神經(jīng)干細胞相關(guān)標(biāo)記物，如Nestin，Mash1，Neurogenin1（Ngn1）等，神經(jīng)元特異性標(biāo)記物表達較弱，與此同時, Oct4開始出現(xiàn)表達減少，而神經(jīng)系多能性標(biāo)記物Sox2表達未見明顯變化。第二階段的誘導(dǎo)分化后，神經(jīng)前體細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟桶纺苌窠?jīng)元樣細胞。最終分化后細胞可表達多巴胺能神經(jīng)元特異性標(biāo)記物酪氨酸羥化酶TH以及神經(jīng)元特異性骨架蛋白Tuj1（βIII Tublin）。分化中細胞的En1、Ptx3、Nurr1、TH的RNA表達水平呈進行性變化，另外，蛋白水平檢測相關(guān)特異性蛋白如TH、Nurr1以及Ptx3等，表達為陽性。功能相關(guān)性分子ALDH1A1、DAT、VMAT的表達呈陽性。而未誘導(dǎo)分化細胞未見表達。對二期誘導(dǎo)分化后進行流式細胞儀檢測計數(shù)，其Tuj1和TH雙陽性比例可達到70%左右。而后，分化的多巴胺能神經(jīng)元進行功能學(xué)鑒定，采用ELISA法對誘導(dǎo)后細胞進行分泌DA的檢測表明，未分化前，DA分泌檢測為陰性，一期誘導(dǎo)分化后也未見DA分泌產(chǎn)生。在二期分化開始約1周后，可檢測出DA的分泌，且DA分泌量呈進行性上升，而分化結(jié)束時DA分泌量趨于穩(wěn)定。表明分化后細胞具有分泌DA的功能。神經(jīng)遞質(zhì)分泌遵循神經(jīng)電位調(diào)控分泌原則的。進一步的實驗檢測表明，誘導(dǎo)分化后神經(jīng)細胞的DA分泌是受鈣離子控制其神經(jīng)遞質(zhì)釋放的。 結(jié)論：第三部分實驗中，我們設(shè)計了對coMAPC細胞的定向誘導(dǎo)分化的兩步走實驗方案，從而實現(xiàn)了coMAPC向多巴胺能神經(jīng)元的定向分化。在分化過程中，coMAPC細胞分別體現(xiàn)了神經(jīng)前體細胞、多巴胺能神經(jīng)元的特征標(biāo)記。在誘導(dǎo)分化后，Tuj1和TH雙陽性細胞的比例可達到約70%，證明我們的二期誘導(dǎo)法具有在定向誘導(dǎo)分化為DA神經(jīng)元時具有較高的效率。這些結(jié)果說明，coMAPC細胞，作為老年人自體骨髓來源的干細胞，同樣具有向多巴胺能神經(jīng)元定向分化的能力和高效率。所以，對于老年性疾病來說，coMAPC細胞可做為合適的種子細胞進行替代治療研究或藥物研發(fā)研究。后續(xù)的分化細胞治療功能研究，還需要進一步的動物體內(nèi)實驗的證實。 小結(jié)：骨髓多能干細胞是一類骨髓來源的保守細胞，從老年人來源的骨髓中可以獲得具有多能性的coMAPC細胞，通過克隆化培養(yǎng)的方式，可以篩選出自我更新能力高、分化潛能好的干細胞，coMAPC比克隆化前表達更低的細胞衰老相關(guān)基因，證明coMAPC具有相當(dāng)年輕化的特征，可能是早期發(fā)育中保存較好的原始干細胞，可作為老年人細胞治療的種子細胞來源。采用特殊的二期誘導(dǎo)分化方法，可誘導(dǎo)該類細胞向多巴胺能神經(jīng)元方向定向分化，從而可以為帕金森病的臨床細胞治療提供合適的種子細胞。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329
【圖文】：

圖 1-1. coMAPC 的培養(yǎng)及不同培養(yǎng)體系對比(1. MAPC 體系, 2. MSC 體系, 體系)A.培養(yǎng) 3d 后(10×10)，圖上紅色箭頭所指處即為三角樣或小梭形 coMAP圓圈內(nèi)為散在紅細胞或白細胞；B.培養(yǎng) 5d 后(10×10)；C. 原代培養(yǎng)達到度后(10×10)。D. coMAPC 穩(wěn)定傳代后形態(tài)均一(20×10)；E. 出現(xiàn)漩渦樣(4×10)；F. coMAPC 核質(zhì)比大。Photos in Light. G. 不同培養(yǎng)體系下老年骨細胞原代增殖時間。(均數(shù)比較用 T test, p <0.05)。2. coMAPC 細胞的克隆化培養(yǎng)克隆化培養(yǎng)過程: 另取 10 份 55 歲以下標(biāo)本，把骨髓標(biāo)本按 55 歲以下和 （含 55 歲）人群來源的進行分組，共 2 組，原代分離培養(yǎng)使用淋巴細胞度梯度離心法進行。在穩(wěn)定傳代后，于 P3 代細胞開始進行極限稀釋法克，接種密度為 0-1 個，在兩組人群中，觀察接種后單細胞生長情況，可見接種后，每個孔板約有 5-10 個左右接種數(shù)量過多或未見細胞貼壁。其余培有為數(shù)不多的單細胞開始生長，克隆化初期，細胞生長速度較慢，約 3-5 天細胞開始出現(xiàn)明顯增殖，其后增殖類似于原代培養(yǎng)。細胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與原

士學(xué)位論文率的比較:克隆形成后，繼續(xù)擴大培養(yǎng)，并進行鑒定。在數(shù)達到 20 次后，即為成功克隆化的單細胞來源 coMA本接種 96 孔后的克隆形成率。統(tǒng)計兩組來源不同的標(biāo)除一份 55 歲以下標(biāo)本因污染而培養(yǎng)失敗外，55 以下人%）高于 55 歲以上人群（平均值 3.23%）圖 1-2G&H。以上人群中，依然可以獲得增殖力穩(wěn)定的單細胞來源 coMAPC 是來自于成體組織內(nèi)儲存的胚胎期干細胞 支持依據(jù)。同時，不同年齡段來源骨髓 coMAPC 克隆形我們，coMAPC 細胞的克隆化培養(yǎng)成功率與供體年齡具

圖 1-3.coMAPC 細胞克隆化培養(yǎng)前后多能性基因表達克隆化培養(yǎng)后，coMAPC 表達 Oct4、Sox2、Nanog，分別由 TRITRITC 標(biāo)記為紅色、綠色和紅色 10×10；B．未克隆化的 MAPC 混多能性分子檢測。DAPI 襯染呈藍色。(放大倍數(shù) 20×10)coMAPC 細胞的分子標(biāo)記表達及流式檢測得穩(wěn)定增殖的 coMAPC 細胞后，我們用免疫熒光細胞法檢測對不法分離培養(yǎng)的 coMAPC 細胞中的常規(guī)分子 Vimentin、CD31、 αSMA 表達情況均進行了檢測。圖 1-4. A-B，可見 Vimentin、S。CD31 為血管內(nèi)皮樣細胞標(biāo)記物，SSEA-1 為 ESC 早期標(biāo)記物織相容性抗原，在我們對 coMAPC 細胞的檢測中，這三種蛋白均未. C-E。地，我們對不同來源人群的 coMAPC 細胞進行流式檢測表面標(biāo)記同人群得到的 coMAPC 細胞中表現(xiàn)一致；而對于不同分離方法，法或全骨髓貼壁培養(yǎng)法分別得到的 coMAPC 細胞，其表面標(biāo)記物圖 1-4F 所示流式細胞儀進行表面標(biāo)記物檢測為第 P8 代 coMAPC

【共引文獻】

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9 楊磊;TNF-α和IFN-γ及含有五種細胞因子的奶牛乳汁對奶牛乳腺纖維化影響的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

10 朱天琦;GDNF和NT-3雙基因誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)樣細胞的實驗研究[D];華中科技大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 周葉萍;Geminin在大鼠血管平滑肌細胞分化表型轉(zhuǎn)化中的介導(dǎo)作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

2 李林峪;Geminin基因過表達對VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響及其分子機制探討[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

3 鞏利;尿酸對帕金森大鼠保護作用及其機制的研究[D];蘇州大學(xué);2013年

4 李文兵;用形狀記憶功能聚合物調(diào)節(jié)表面微圖案的研究[D];西南交通大學(xué);2013年

5 陳明;骨髓單個核細胞在腦缺血大鼠腦內(nèi)受損區(qū)域的定向分化[D];鄭州大學(xué);2013年

6 徐揚陽;重組人堿性成纖維細胞生長因子對脂肪干細胞分化的影響[D];鄭州大學(xué);2013年

7 劉靜;P16基因高表達對細胞衰老的調(diào)控作用[D];鄭州大學(xué);2013年

8 任爽;頭孢曲松改善血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶功能及其機制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

9 于曉云;骨髓間充質(zhì)干細胞移植對慢性腦缺血大鼠海馬區(qū)Cdc42表達及認知功能的影響[D];鄭州大學(xué);2013年

10 馬云鵬;應(yīng)用大塊平鋪法對人臍帶間充質(zhì)干細胞分離、傳代、凍存及復(fù)蘇的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號：2771061