發(fā)布時(shí)間：2020-07-26 17:19

【摘要】：前言 干細(xì)胞指的是同時(shí)具有自我更新能力和多向分化潛能的一類細(xì)胞，干細(xì)胞從來(lái)源可分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESC)和不同組織來(lái)源的成體干細(xì)胞(adultstem cells, ASC)。其中ESC來(lái)自于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán),先后從小鼠、靈長(zhǎng)目動(dòng)物及人中分離得到。ESC具有近乎無(wú)限的自我更新和分化能力，可以產(chǎn)生三個(gè)胚層方向的終末分化細(xì)胞，進(jìn)而形成各種器官包括中、內(nèi)和外胚層器官。ASC研究最早最深入的是造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSC)。之后又陸續(xù)報(bào)道了神經(jīng)干細(xì)胞(neural stemcells, NSC)、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells)、以及其他來(lái)源的干細(xì)胞種類，如腸干細(xì)胞，表皮干細(xì)胞，肝干細(xì)胞（也稱卵圓細(xì)胞）等。在組織生長(zhǎng)與再生過(guò)程中，干細(xì)胞會(huì)不斷的改變其性狀：在胚胎發(fā)育期，干細(xì)胞快速分裂實(shí)現(xiàn)迅速生長(zhǎng)；到青春期后，個(gè)體生長(zhǎng)變慢或停止，而大部分干細(xì)胞也進(jìn)入休眠，僅為維持組織自穩(wěn)態(tài)而產(chǎn)生分裂增殖；到老年后，干細(xì)胞表達(dá)更多的抑癌性的管家基因，從而降低癌癥發(fā)生率，但同時(shí)也降低了再生能力，即細(xì)胞發(fā)生衰老，干細(xì)胞內(nèi)部的這些改變一般通過(guò)常染色體基因的變化來(lái)體現(xiàn)。 目前已知的衰老機(jī)制為，組成細(xì)胞的各種理化物質(zhì)在機(jī)體運(yùn)動(dòng)中不斷受到內(nèi)外環(huán)境的影響而發(fā)生損傷，造成功能退行性下降。細(xì)胞衰老是細(xì)胞在經(jīng)歷了增殖、分化過(guò)程后，不可避免出現(xiàn)的，各細(xì)胞器在內(nèi)外環(huán)境的損傷因素下，因缺乏完善的修復(fù)，使“差錯(cuò)”積累，導(dǎo)致細(xì)胞衰老，是機(jī)體發(fā)育過(guò)程中的一種正常生命現(xiàn)象。其特征包括：細(xì)胞內(nèi)酶的活性降低；色素積累；細(xì)胞內(nèi)呼吸速度減慢，胞核增大，核膜內(nèi)折，染色質(zhì)收縮，顏色加深。線粒體數(shù)量減少，體積增大；胞膜通透性功能改變，使物質(zhì)運(yùn)輸功能降低等。分子水平的變化主要有DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)抑制，RNA含量降低，蛋白翻譯和合成減少，以及細(xì)胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸等的氧化現(xiàn)象等。在衰老形成各種原因中，年齡與衰老無(wú)疑具有最大的相關(guān)性，并可引起與細(xì)胞衰老相關(guān)的多種疾病，如阿爾茲海默（老年性癡呆）、帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)、關(guān)節(jié)退行性改變等等各種疾病。 PD是一種神經(jīng)退行性疾病，在55歲以上人群中發(fā)病率高達(dá)1%以上，在中外流行病學(xué)分析中都有報(bào)道。已知帕金森的發(fā)病是由于中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元受損引起，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(Dopamine, DA)的減少，從而引起相關(guān)神經(jīng)傳導(dǎo)異常，而導(dǎo)致一系列的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，包括靜止性震顫，自主運(yùn)動(dòng)等。目前PD的常規(guī)治療方法仍然是藥物療法，常用左旋多巴等藥物以替代多巴胺，但會(huì)導(dǎo)致一系列的副作用。與此同時(shí)，PD作為一種由單一細(xì)胞種類損壞引起的疾病，干細(xì)胞治療是非常值得期待的療法。 目前認(rèn)為可能用于PD治療的干細(xì)胞來(lái)源包括ESC，NSC，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, IPS)，MSC等。ESC體外向DA神經(jīng)元分化已有報(bào)道。但是胚胎干細(xì)胞一般是來(lái)自于異源性組織的細(xì)胞，有免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。近來(lái)有成體細(xì)胞核移植獲得的ESC，即SCNT-ES，可避免免疫排斥反應(yīng)，但在體內(nèi)有成畸胎瘤的可能，且ESC的倫理學(xué)爭(zhēng)議較多。NSC，一般來(lái)自于胚腦神經(jīng)組織，體外也可分化為腦組織中幾乎所有類型的神經(jīng)元，包括DA神經(jīng)元。但是NSC分化潛能比ESC較弱，定向分化效率也較低，同時(shí)來(lái)源有限，且有倫理學(xué)爭(zhēng)議。IPS的發(fā)現(xiàn)，使干細(xì)胞的理念進(jìn)一步更新，IPS具有與胚胎干細(xì)胞相類似的全能性，且細(xì)胞可來(lái)自于自體，體外分化為DA神經(jīng)元也有報(bào)道，但I(xiàn)PS需要導(dǎo)入基因，安全性仍未明確。所以目前仍然以自體來(lái)源的尤其是骨髓來(lái)源的干細(xì)胞最為方便及安全。但是對(duì)于PD老年人群，自體骨髓干細(xì)胞是否存在，效果如何，仍未可知。 本課題設(shè)計(jì)了老年人來(lái)源的骨髓多能祖細(xì)胞（clonal older-derived multipotentprogenitor cells, coMAPC）的分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，尋求合適的培養(yǎng)體系，以驗(yàn)證成體來(lái)源的骨髓干細(xì)胞的多能性及干細(xì)胞特征。通過(guò)克隆化培養(yǎng)，獲得單個(gè)干細(xì)胞來(lái)源的coMAPC細(xì)胞系，使coMAPC細(xì)胞更為純化。coMAPC細(xì)胞表達(dá)多種干細(xì)胞多能性標(biāo)記物Oct4，Sox2，Nanog，克隆化培養(yǎng)也使coMAPC保持更好的分化多能性和自我更新性。全基因組芯片分析證實(shí)coMAPC表達(dá)更低的衰老基因，證實(shí)了老年人骨髓中依然存在多能性依然保持較好的干細(xì)胞。采用特異性的二步法定向誘導(dǎo)coMAPC，即RA+bFGF誘導(dǎo)7天和Shh+neuralbasal誘導(dǎo)14天后，可定向誘導(dǎo)coMAPC分化為具有DA神經(jīng)元樣特征的細(xì)胞，并可分泌產(chǎn)生DA神經(jīng)遞質(zhì)的功能性細(xì)胞。 Part：老年骨髓多能干細(xì)胞多能性干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定 方法：(1) coMAPC細(xì)胞的原代分離和培養(yǎng)：骨髓組織來(lái)源于臨床志愿者捐獻(xiàn)，采集年齡主要位于50-70歲區(qū)間，coMAPC培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基含59%DMEM，39%MCDB，1×ITS，1×HSA，1×LA，10-9M Dex，2%FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)液，添加劑包括10ng/mL EGF，10ng/mLPDGF-BB。分離方法包括淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法和全骨髓貼壁法兩種，之后極限稀釋后進(jìn)行單克隆化培養(yǎng)獲得coMAPC細(xì)胞：（2）coMAPC細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定：細(xì)胞計(jì)數(shù)情況繪制生長(zhǎng)曲線；并計(jì)算得出細(xì)胞倍增時(shí)間，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行全面整體評(píng)估。（3）細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備以及染色體數(shù)目分析：秋水仙素處理增殖期細(xì)胞，觀察記錄分散良好的分裂相。（4）免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)不同傳代次數(shù)的coMAPC細(xì)胞分子表達(dá)。FCM檢測(cè)不同傳代次數(shù)后的coMAPC細(xì)胞，包括鑒定coMAPC細(xì)胞的表面分子標(biāo)記物特征和細(xì)胞周期測(cè)定。（5）cMAPC的三胚層多向誘導(dǎo)分化：成脂、成軟骨、成骨、成血管內(nèi)皮、成肝細(xì)胞、成神經(jīng)誘導(dǎo)后，分別用油紅O染液、阿爾辛藍(lán)染色、茜素紅、CD31、vWF、Albumin和GFAP、Nestin、TAU、Tuj1等標(biāo)記染色。（6）GFP標(biāo)記的慢病毒Lentivirus感染標(biāo)記coMAPC細(xì)胞：準(zhǔn)備預(yù)先包裝成功的缺陷病毒液，以及polybrene，按照相應(yīng)濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。 結(jié)果：（1）對(duì)不同年齡段人群來(lái)源的骨髓多能祖細(xì)胞進(jìn)行了多種方法的分離培養(yǎng)，coMAPC細(xì)胞可從幾乎所有年齡段的成體骨髓組織中分離獲得。（2）表面標(biāo)記物檢測(cè)表明，coMAPC細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD105、CD106等，但不表達(dá)CD34、CD45等造血系統(tǒng)來(lái)源標(biāo)記。同時(shí)人類白細(xì)胞抗原HLA-1經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)也為陰性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期也表明，在目前的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件下，coMAPC的穩(wěn)定增殖在前10次傳代內(nèi)基本保持穩(wěn)定。細(xì)胞核型二倍體比例均為100%，同時(shí)細(xì)胞周期中處于靜止期或增殖準(zhǔn)備期（G0/G1期）的比例均在80%以上，凋亡細(xì)胞的比例為5%以下。上述結(jié)果表明coMAPC體外分離培養(yǎng)后可以獲得較穩(wěn)定的自我更新能力。（3）coMAPC表達(dá)一般中胚層來(lái)源的細(xì)胞骨架蛋白Vimentin，αSMA，coMAPC依然保留了中胚層來(lái)源的相關(guān)特征分子。而CD31、SSEA-1和MHC-I表達(dá)為陰性。在細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制中，可以看出coMAPC經(jīng)歷約3d左右的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，進(jìn)入增殖平臺(tái)期。分時(shí)計(jì)數(shù)可算得coMAPC細(xì)胞倍增時(shí)間約為30h。（4）慢病毒感染coMAPC細(xì)胞同樣具有較高感染效率，且對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)未見明顯影響。 結(jié)論：coMAPC可從不同年齡段人群的骨髓中分離獲得，且使用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法可更快更有效獲得較為純化的coMAPC細(xì)胞，現(xiàn)有培養(yǎng)體系和克隆化得到的coMAPC細(xì)胞，可以較為穩(wěn)定的擴(kuò)增，維持其自我更新能力。coMAPC表達(dá)Oct4、Sox2、Nanog等多能性基因，具有多向分化能力，coMAPC細(xì)胞的增殖曲線和細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，對(duì)于長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)以及骨髓標(biāo)本來(lái)源較年長(zhǎng)的體外培養(yǎng)細(xì)胞，其自我更新能力與穩(wěn)定性不可避免會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間和傳代次數(shù)增多而下降。慢病毒感染coMAPC細(xì)胞同樣具有較高感染效率，且對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)未見明顯影響。 Part II：?jiǎn)慰寺』睦夏旯撬瓒嗄芨杉?xì)胞干性及特性分析 方法：（1）coMAPC全基因組表達(dá)譜芯片分析比較。抽提coMAPC細(xì)胞的totalRNA。（2）total RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA文庫(kù)后，以cDNA為模板合成帶有生物素biotin標(biāo)記的antisense RNA(aRNA)。（3）aRNA進(jìn)行片段化處理后，同Human GenomeU133Plus2.0Array芯片進(jìn)行雜交。（4）使用Affymetrix公司的GeneChip2Scanner30007G掃描儀進(jìn)行芯片掃描解讀并與數(shù)據(jù)庫(kù)中信息分析比較差異表達(dá)基因。（5）coMAPC細(xì)胞衰老基因的鑒定及比較：PCR法進(jìn)行細(xì)胞周期調(diào)控分子p16, p19, p21, hTERT以及p53的mRNA檢測(cè)，WB檢測(cè)p16, p19, p21, hTERT以及p53的蛋白水平表達(dá)。（6）coMAPC克隆間多能性基因的表達(dá)比較，RNA水平比較基因?yàn)镺ct4、Sox2、 Nanog、Oct4A、Oct4B。蛋白檢測(cè)指標(biāo)為Oct4、Sox2、 Nanog。 結(jié)果：克隆化培養(yǎng)后，coMAPC細(xì)胞成為真正意義上的單個(gè)細(xì)胞來(lái)源的高純度細(xì)胞群。cMAPC細(xì)胞的多能性基因Oct4、Sox2、Nanog等進(jìn)行了RNA水平的比較分析。挑選出表達(dá)較高較穩(wěn)定的D8株coMAPC細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)增及后續(xù)檢測(cè)。IF檢測(cè)也證實(shí)D8可穩(wěn)定表達(dá)多能性基因并位于細(xì)胞核內(nèi)。對(duì)coMAPC細(xì)胞的全基因組芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中MSC及ESC基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，證實(shí)coMAPC細(xì)胞周期相關(guān)基因存在差異化表達(dá)。PCR與WB檢測(cè)結(jié)果表明p16，p19，P21和P53等衰老相關(guān)基因在coMAPC細(xì)胞內(nèi)總體表達(dá)水平有所降低。而細(xì)胞增殖能力相關(guān)分子，hTERT的表達(dá)，在細(xì)胞總體水平有所升高。 結(jié)論：總結(jié)這一部分實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為，coMAPC來(lái)源與自體骨髓，這種細(xì)胞在老年人骨髓中依然存在，而多能性分子的表達(dá)和三胚層方向多向誘導(dǎo)分化的陽(yáng)性結(jié)果，提示老年人來(lái)源的coMAPC細(xì)胞，同樣具有多能性分子的表達(dá)和穩(wěn)定的自我更新能力。全基因組芯片檢測(cè)比較coMAPC與MSC及ESC證實(shí)了coMAPC具有相對(duì)年輕化的基因表達(dá)特征，GO分析與Pathway分析提示細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)節(jié)通路蛋白差異顯著。p16，p19，P21和P53等衰老相關(guān)基因低表達(dá)表明克隆化培養(yǎng)方式可以篩選出具有年輕化性質(zhì)的coMAPC細(xì)胞。coMAPC可以作為老年人細(xì)胞治療的種子細(xì)胞。 PART III：老年骨髓多能干細(xì)胞(coMAPC)向多巴胺能神經(jīng)元的定向分化 方法：（1）二期誘導(dǎo)法誘導(dǎo)coMAPC細(xì)胞定向分化，第一期為coMAPC的神經(jīng)外胚層誘導(dǎo)：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，消化獲得單細(xì)胞懸液。細(xì)胞接種至FN處理后的6孔板爬片上，接種密度為3000個(gè)/cm2，基礎(chǔ)培養(yǎng)基+bFGF（50ng/ml）+RA（10-8M）誘導(dǎo)7-10天。（2）第二階段為多巴胺能神經(jīng)元分階段定向分化：棄掉一期誘導(dǎo)培養(yǎng)液，PBS清洗2次后，加入二期誘導(dǎo)培養(yǎng)液neuralbasal（購(gòu)自Gibco公司）+SHH（RD250ng/ml）+Nurr1（RD200ng/ml）。每3天半量換液一次。維持14天。（3）免疫熒光檢測(cè)coMAPC細(xì)胞定向分化過(guò)程中的神經(jīng)標(biāo)記物Tuj1，TH，En1，Ptx3，Nurr1，ALDH1A1，DAT，VMAT等（4）FCM檢測(cè)TH與Tuj1雙陽(yáng)性比例，比較二期誘導(dǎo)法與已知誘導(dǎo)方法的分化效率。（5）coMAPC分化為多巴胺能神經(jīng)元的功能鑒定。功能鑒定主要檢測(cè)DA的分泌功能。使用酶聯(lián)免疫反應(yīng)吸附試驗(yàn)Elisa試劑盒完成。 結(jié)果：對(duì)克隆化培養(yǎng)的老年多能成體祖細(xì)胞coMAPC細(xì)胞進(jìn)行向多巴胺能神經(jīng)元的定向誘導(dǎo)：在使用多種誘導(dǎo)因子和條件的情況下，通過(guò)分兩步誘導(dǎo)的方法，成功的獲得了具有多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)記物且可產(chǎn)生特定物質(zhì)TH的神經(jīng)元樣細(xì)胞。第一階段，成功獲得了類神經(jīng)干細(xì)胞，可出現(xiàn)神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)。分化后細(xì)胞可表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物，如Nestin，Mash1，Neurogenin1（Ngn1）等，神經(jīng)元特異性標(biāo)記物表達(dá)較弱，與此同時(shí), Oct4開始出現(xiàn)表達(dá)減少，而神經(jīng)系多能性標(biāo)記物Sox2表達(dá)未見明顯變化。第二階段的誘導(dǎo)分化后，神經(jīng)前體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟桶纺苌窠?jīng)元樣細(xì)胞。最終分化后細(xì)胞可表達(dá)多巴胺能神經(jīng)元特異性標(biāo)記物酪氨酸羥化酶TH以及神經(jīng)元特異性骨架蛋白Tuj1（βIII Tublin）。分化中細(xì)胞的En1、Ptx3、Nurr1、TH的RNA表達(dá)水平呈進(jìn)行性變化，另外，蛋白水平檢測(cè)相關(guān)特異性蛋白如TH、Nurr1以及Ptx3等，表達(dá)為陽(yáng)性。功能相關(guān)性分子ALDH1A1、DAT、VMAT的表達(dá)呈陽(yáng)性。而未誘導(dǎo)分化細(xì)胞未見表達(dá)。對(duì)二期誘導(dǎo)分化后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)計(jì)數(shù)，其Tuj1和TH雙陽(yáng)性比例可達(dá)到70%左右。而后，分化的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行功能學(xué)鑒定，采用ELISA法對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行分泌DA的檢測(cè)表明，未分化前，DA分泌檢測(cè)為陰性，一期誘導(dǎo)分化后也未見DA分泌產(chǎn)生。在二期分化開始約1周后，可檢測(cè)出DA的分泌，且DA分泌量呈進(jìn)行性上升，而分化結(jié)束時(shí)DA分泌量趨于穩(wěn)定。表明分化后細(xì)胞具有分泌DA的功能。神經(jīng)遞質(zhì)分泌遵循神經(jīng)電位調(diào)控分泌原則的。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明，誘導(dǎo)分化后神經(jīng)細(xì)胞的DA分泌是受鈣離子控制其神經(jīng)遞質(zhì)釋放的。 結(jié)論：第三部分實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)計(jì)了對(duì)coMAPC細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化的兩步走實(shí)驗(yàn)方案，從而實(shí)現(xiàn)了coMAPC向多巴胺能神經(jīng)元的定向分化。在分化過(guò)程中，coMAPC細(xì)胞分別體現(xiàn)了神經(jīng)前體細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元的特征標(biāo)記。在誘導(dǎo)分化后，Tuj1和TH雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例可達(dá)到約70%，證明我們的二期誘導(dǎo)法具有在定向誘導(dǎo)分化為DA神經(jīng)元時(shí)具有較高的效率。這些結(jié)果說(shuō)明，coMAPC細(xì)胞，作為老年人自體骨髓來(lái)源的干細(xì)胞，同樣具有向多巴胺能神經(jīng)元定向分化的能力和高效率。所以，對(duì)于老年性疾病來(lái)說(shuō)，coMAPC細(xì)胞可做為合適的種子細(xì)胞進(jìn)行替代治療研究或藥物研發(fā)研究。后續(xù)的分化細(xì)胞治療功能研究，還需要進(jìn)一步的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。 小結(jié)：骨髓多能干細(xì)胞是一類骨髓來(lái)源的保守細(xì)胞，從老年人來(lái)源的骨髓中可以獲得具有多能性的coMAPC細(xì)胞，通過(guò)克隆化培養(yǎng)的方式，可以篩選出自我更新能力高、分化潛能好的干細(xì)胞，coMAPC比克隆化前表達(dá)更低的細(xì)胞衰老相關(guān)基因，證明coMAPC具有相當(dāng)年輕化的特征，可能是早期發(fā)育中保存較好的原始干細(xì)胞，可作為老年人細(xì)胞治療的種子細(xì)胞來(lái)源。采用特殊的二期誘導(dǎo)分化方法，可誘導(dǎo)該類細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元方向定向分化，從而可以為帕金森病的臨床細(xì)胞治療提供合適的種子細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329
【圖文】：

圖 1-1. coMAPC 的培養(yǎng)及不同培養(yǎng)體系對(duì)比(1. MAPC 體系, 2. MSC 體系, 體系)A.培養(yǎng) 3d 后(10×10)，圖上紅色箭頭所指處即為三角樣或小梭形 coMAP圓圈內(nèi)為散在紅細(xì)胞或白細(xì)胞；B.培養(yǎng) 5d 后(10×10)；C. 原代培養(yǎng)達(dá)到度后(10×10)。D. coMAPC 穩(wěn)定傳代后形態(tài)均一(20×10)；E. 出現(xiàn)漩渦樣(4×10)；F. coMAPC 核質(zhì)比大。Photos in Light. G. 不同培養(yǎng)體系下老年骨細(xì)胞原代增殖時(shí)間。(均數(shù)比較用 T test, p <0.05)。2. coMAPC 細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)克隆化培養(yǎng)過(guò)程: 另取 10 份 55 歲以下標(biāo)本，把骨髓標(biāo)本按 55 歲以下和 （含 55 歲）人群來(lái)源的進(jìn)行分組，共 2 組，原代分離培養(yǎng)使用淋巴細(xì)胞度梯度離心法進(jìn)行。在穩(wěn)定傳代后，于 P3 代細(xì)胞開始進(jìn)行極限稀釋法克，接種密度為 0-1 個(gè)，在兩組人群中，觀察接種后單細(xì)胞生長(zhǎng)情況，可見接種后，每個(gè)孔板約有 5-10 個(gè)左右接種數(shù)量過(guò)多或未見細(xì)胞貼壁。其余培有為數(shù)不多的單細(xì)胞開始生長(zhǎng)，克隆化初期，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，約 3-5 天細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯增殖，其后增殖類似于原代培養(yǎng)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與原

士學(xué)位論文率的比較:克隆形成后，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行鑒定。在數(shù)達(dá)到 20 次后，即為成功克隆化的單細(xì)胞來(lái)源 coMA本接種 96 孔后的克隆形成率。統(tǒng)計(jì)兩組來(lái)源不同的標(biāo)除一份 55 歲以下標(biāo)本因污染而培養(yǎng)失敗外，55 以下人%）高于 55 歲以上人群（平均值 3.23%）圖 1-2G&H。以上人群中，依然可以獲得增殖力穩(wěn)定的單細(xì)胞來(lái)源 coMAPC 是來(lái)自于成體組織內(nèi)儲(chǔ)存的胚胎期干細(xì)胞 支持依據(jù)。同時(shí)，不同年齡段來(lái)源骨髓 coMAPC 克隆形我們，coMAPC 細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)成功率與供體年齡具

圖 1-3.coMAPC 細(xì)胞克隆化培養(yǎng)前后多能性基因表達(dá)克隆化培養(yǎng)后，coMAPC 表達(dá) Oct4、Sox2、Nanog，分別由 TRITRITC 標(biāo)記為紅色、綠色和紅色 10×10；B．未克隆化的 MAPC 混多能性分子檢測(cè)。DAPI 襯染呈藍(lán)色。(放大倍數(shù) 20×10)coMAPC 細(xì)胞的分子標(biāo)記表達(dá)及流式檢測(cè)得穩(wěn)定增殖的 coMAPC 細(xì)胞后，我們用免疫熒光細(xì)胞法檢測(cè)對(duì)不法分離培養(yǎng)的 coMAPC 細(xì)胞中的常規(guī)分子 Vimentin、CD31、 αSMA 表達(dá)情況均進(jìn)行了檢測(cè)。圖 1-4. A-B，可見 Vimentin、S。CD31 為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞標(biāo)記物，SSEA-1 為 ESC 早期標(biāo)記物織相容性抗原，在我們對(duì) coMAPC 細(xì)胞的檢測(cè)中，這三種蛋白均未. C-E。地，我們對(duì)不同來(lái)源人群的 coMAPC 細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)表面標(biāo)記同人群得到的 coMAPC 細(xì)胞中表現(xiàn)一致；而對(duì)于不同分離方法，法或全骨髓貼壁培養(yǎng)法分別得到的 coMAPC 細(xì)胞，其表面標(biāo)記物圖 1-4F 所示流式細(xì)胞儀進(jìn)行表面標(biāo)記物檢測(cè)為第 P8 代 coMAPC

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2771061