【摘要】：脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus,PV)是脊髓灰質(zhì)炎的病原體,可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng),損害脊髓前角運動神經(jīng)細胞。PV屬于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus,EV),它的基因可以編碼一個約250 kDa的前體蛋白(polyprotein)。病毒前體蛋白被自身的蛋白酶2A和3C切割形成11個成熟的具有功能的蛋白,其中包括4種結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白):VPO,VP1和VP3,以及7種非結(jié)構(gòu)蛋白:2A,2B,2C,3A,3B,3C和3D。非結(jié)構(gòu)蛋白2C及其前體蛋白2BC介導了病毒感染的細胞中膜組分的變構(gòu)與基于膜結(jié)構(gòu)的病毒復制復合物的組裝,此外,還參與了包括病毒的脫衣殼、天然免疫逃逸和病毒衣殼的形成等病毒生命周期中的重要過程。2017年關(guān)洪鑫博士等解析了EV71 2C 116-329的結(jié)構(gòu),這項研究成果填補了多年來2C結(jié)構(gòu)信息方面的空缺。本課題成功解析了 PV2C116-329的2.55A的高分辨率晶體結(jié)構(gòu),這是我們繼EV71后解析的第二個微小核糖核酸病毒科的2C蛋白結(jié)構(gòu)。解析的2C蛋白結(jié)構(gòu)當中包含三個subdomain:ATPase結(jié)構(gòu)域,鋅指結(jié)構(gòu)域和一個長的C末端兩親性α螺旋(或pocket binding domain,PBD)。其中ATPase結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域之間的疏水氨基酸形成了一個疏水性的“口袋(pocket)”。這兩個結(jié)構(gòu)的不同之處在于鋅指結(jié)構(gòu)的構(gòu)造,EV71的鋅指有三個配體,而PV的鋅指結(jié)構(gòu)有四個配體。與EV712C蛋白的結(jié)構(gòu)相似的是,PV 2C的C末端兩親性α螺旋通過疏水相互作用與相鄰的一個2C蛋白的疏水性“口袋”相互結(jié)合,在晶體中同樣是以多聚體的形式存在;與此同時分子篩柱層析的實驗結(jié)果表明PV2C在溶液中是以四聚體的形式存在的。我們挑選了參與構(gòu)成三個結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵氨基酸進行單點突變,檢測其突變體的ATPase酶活性,結(jié)果表明這種寡聚化形式是2C蛋白發(fā)揮ATPase活性的結(jié)構(gòu)前提。我們知道AAA+ATPase超家族的蛋白通常會形成環(huán)狀六聚體結(jié)構(gòu)來行使功能,2C蛋白屬于該家族成員,并且電鏡學研究也表明2C蛋白可以形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),因此我們推測PV 2C也會形成環(huán)狀六聚體結(jié)構(gòu)。我們以SV40 Large TAntigen(LTAg)的六聚體為模版,參考EV71 2C 116-329的六聚體模型,模擬構(gòu)建了 PV2C的六聚體模型。并且我們以該模型為模版,把之前發(fā)現(xiàn)的所有的與功能相關(guān)的位點以及抑制劑抗性位點都定位到了這個六聚體模型上,這便為進一步深入探討2C的功能提供了重要的結(jié)構(gòu)生物學基礎(chǔ),同時這個研究成果也將為設(shè)計靶向2C抑制劑研發(fā)提供了重要的科學依據(jù)。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R373
【圖文】：

圖１微�。遥危敛�?

２腸道病毒屬和口蹄疫病毒屬的病毒多聚蛋白剪切。病毒ＲＮＡ與病毒編碼（ｖｉｒｕｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＶＰｇ）在其５＇端連接。開放閱讀框（ＯＲＦ）編碼一個多聚蛋白，衣殼體（Ｐ１）的釋放在腸道病毒中是由２Ａ邋（黑色箭頭）切割的，在口蹄疫病毒中是通過ＮＰＧｏｔｉｆ邋（白色箭頭）完成的。Ｐ２和Ｐ３多肽是基因組復制所必需的非結(jié)構(gòu)蛋白前體。進一步白剪切是由３Ｃ來進行的。ＬＰ？通過自剪切從Ｐ１中釋放出來。ＶＰ０是ＶＰ４和ＶＰ２的前體，是自催化的。底部的編碼指的是卩NB１（NB０１１４９）和卩１＾0￥0６（八丫５９３８２９）的基因組［８，９］。逡逑邋２Ｃ蛋白的研究現(xiàn)狀逡逑．１邋２Ｃ蛋白簡介逡逑非結(jié)構(gòu)蛋白２Ｃ是微小ＲＮＡ病毒研宄領(lǐng)域中最受關(guān)注的蛋白之一，它在ＮＡ病毒當中高度保守。２Ｃ通常由？３３０個氨基酸組成，遺傳學研究已經(jīng)確２Ｃ的許多功能，包括脫衣殼［１０］、宿主膜重排［１１，邋１２］、病毒ＲＮＡ結(jié)合［１３］、ＮＡ復制［１４］和衣殼化［１５，邋１６］等。該蛋白被顯示為低聚物［１７，邋１８］，并與衣殼Ｐ３和非結(jié)構(gòu)蛋白２Ｂ和２ＢＣ、３Ａ和３ＡＢ和３Ｃ相互作用。逡逑一

學科學院＆北京協(xié)和醫(yī)學院邐碩士學位白的１７－３４區(qū)段也可以形成一個兩親性ａ－螺旋，該結(jié)構(gòu)參與了邋２Ｃ蛋膜融合過程，從而介導細胞膜的重排和基因組復制復合物的形成［１端３３個氨基酸的ＦＭＤＶ邋２Ｃ蛋白可以獲得可溶性表達，并且該蛋活性和ＲＮＡ結(jié)合能力，同時在底物ＡＴＰ和ＲＮＡ存在的情況下，在到六聚體［２１］。逡逑蛋白的Ｎ端結(jié)構(gòu)域之后有一個標準的ＡＴＰａｓｅ結(jié)構(gòu)域，包含了典型的ＸＸＧＫ（Ｔ／Ｓ）模序、Ｗａｌｋｅｒ邋Ｂ邋（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸＸＧＸＸＸＸＬｈｈｈｈＤ邋模序和邋ＳＦ３Ｍｏｔｉｆ邋Ｃ邋（Ｎ２２３）模序［２２］。１９９３年Ｐｅｄｒｏ在研究ＰＶ邋２Ｃ蛋白時證明ａｓｅ活性［２３］。２０１５年周溪首次發(fā)現(xiàn)了邋ＥＶ７１邋２Ｃ具有ＡＴＰ依賴的３’－５’不依賴ＡＴＰ底物的分子伴侶功能，它可以在沒有ＡＴＰ的情況下雙鏈，并且能夠幫助ＲＮＡ退火形成新的ＲＮＡ構(gòu)象［２４］。逡逑

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本文編號：2770936