【摘要】：1.目的:通過研究間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在不同共培養(yǎng)模式下對(duì)造血干細(xì)胞(HSC)體外增殖的影響,并探究其機(jī)制,從而盡可能真實(shí)地模擬體內(nèi)HSC增殖的骨髓微環(huán)境,尋找更好的促進(jìn)HSC體外增殖的方法。方法:1.C57小鼠MSC分離、培養(yǎng):采用全骨髓培養(yǎng)法,將C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞,在胎牛血清含量為10%、青-鏈霉素含量為1%、DMEM-F12含量為89%的培養(yǎng)基中培養(yǎng),第一個(gè)48h行半量換液,此后每隔2天行全量換液一次,于倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)對(duì)細(xì)胞的形態(tài)變化及生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察。至培養(yǎng)瓶底面的細(xì)胞長(zhǎng)至約90%融合時(shí),按1:2比例傳代。連續(xù)觀察P0、P1、P2、P3代MSC生長(zhǎng)情況、形態(tài)變化。2.GFP小鼠HSC的分離、鑒定:通過密度梯度離心,獲得稀釋液層下的小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞(MNC),MACS-CD117+磁珠分選HSC。應(yīng)用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(FACS)檢測(cè)CD117陽性細(xì)胞的純度。3.間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖的研究:設(shè)置對(duì)照組:HSC組(24孔板內(nèi)單獨(dú)接種造血干細(xì)胞)、MSC組(24孔板內(nèi)單獨(dú)接種間充質(zhì)干細(xì)胞);實(shí)驗(yàn)組:Transwell共培養(yǎng)組(24孔板對(duì)應(yīng)規(guī)格Transwell內(nèi)單獨(dú)接種造血干細(xì)于上室、間充質(zhì)干細(xì)胞于下室)、2D接觸共培養(yǎng)組(24孔板共同接種造血干細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞)。體外培養(yǎng)7天,觀察HSC生長(zhǎng)情況、形態(tài)變化、進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、并繪制生長(zhǎng)曲線、Cell Counting Kit(CCK-8)法測(cè)定HSC擴(kuò)增情況。測(cè)定各個(gè)組MSC細(xì)胞數(shù)量,ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中SDF-1及VFGF的表達(dá)情況。結(jié)果:1.C57BL/6小鼠的MSC的分離培養(yǎng):倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)5天開始出現(xiàn)梭形貼壁細(xì)胞,約第12天梭形細(xì)胞融合度可達(dá)90%-95%。傳代后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)較快,多在24 h內(nèi)貼壁。傳至第3代后6-7天可生長(zhǎng)達(dá)80%融合并呈長(zhǎng)梭形密集排列。間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)傳代后的細(xì)胞純度逐漸升高。2.GFP小鼠的HSC的分離鑒定:實(shí)驗(yàn)中平均每只GFP小鼠的骨髓細(xì)胞液經(jīng)密度梯度離心后可以獲得約5.5×107個(gè)單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活性細(xì)胞率為97%。MNC經(jīng)MACS CD117磁珠分選后,平均可以獲得約1.3×105個(gè)CD117+細(xì)胞,活細(xì)胞率為98%。骨髓MNC中CD117+細(xì)胞含量約0.24%。熒光顯微鏡下可見HSC呈圓形,并可激發(fā)出綠色熒光,大小均一。流式鑒定結(jié)果顯示,磁珠分選后的CD117+HSC純度為99.51%。3.不同培養(yǎng)模式下間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)造血干細(xì)胞增殖的影響:(1)鏡下觀察MSC對(duì)HSC增殖的影響:熒光顯微鏡觀察顯示:各組HSC細(xì)胞數(shù)量隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增多,且2D共培養(yǎng)組熒光細(xì)胞數(shù)量較其他組明顯增多;(2)計(jì)數(shù)法檢測(cè)MSC對(duì)HSC增殖的影響:對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行分析:共培養(yǎng)第1天,3組HSC活性細(xì)胞數(shù)量與接種時(shí)(d0)比較,HSC組(control group,單獨(dú)培養(yǎng)HSC組)與接種時(shí)比較,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.151);Transwell共培養(yǎng)組與接種時(shí)比較,P=0.010;2D共培養(yǎng)組與接種時(shí)比較,P=0.002。共培養(yǎng)第1天比較3組中HSC數(shù)量,HSC單獨(dú)培養(yǎng)組與Transwell組比較,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.718);2D組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P=0.000;2D組高于Transwell組,P=0.0000。共培養(yǎng)第3天,3組間HSC細(xì)胞數(shù)量比較,Transwell共培養(yǎng)組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P=0.004;2D共培養(yǎng)組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P=0.002;2D共培養(yǎng)組高于Transwell共培養(yǎng)組,P=0.010。共培養(yǎng)第5天,3組間HSC細(xì)胞數(shù)量比較,Transwell共培養(yǎng)組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P=0.039;2D共培養(yǎng)組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P=0.001;2D共培養(yǎng)組高于Transwell共培養(yǎng)組,P=0.000。共培養(yǎng)第7天,3組間HSC細(xì)胞數(shù)量比較,Transwell共培養(yǎng)組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P=0.001;2D共培養(yǎng)組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P=0.000;2D共培養(yǎng)組高于Transwell共培養(yǎng)組,P=0.000。(3)CCK-8法檢測(cè)HSC增殖:對(duì)1、3、5、7天HSC樣本進(jìn)行CCK-8檢測(cè)OD值,從生長(zhǎng)曲線可以看出,隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)各組HSC數(shù)量均隨之增加,第3天開始HSC細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,與MSC共培養(yǎng)對(duì)HSC增殖有促進(jìn)作用,2D共培養(yǎng)模式較Transwell共培養(yǎng)的促進(jìn)作用更明顯。共培養(yǎng)第一天,HSC單獨(dú)培養(yǎng)組與Transwell共培養(yǎng)組比較,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.151);HSC單獨(dú)培養(yǎng)組與2D共培養(yǎng)組比較,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.054)。共培養(yǎng)3-7天,共培養(yǎng)組細(xì)胞增殖明顯高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P0.05;且2D共培養(yǎng)組明顯高于Transwell共培養(yǎng)組,P0.05。4.不同培養(yǎng)模式下,間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖可能的機(jī)制:(1)培養(yǎng)第7天,采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中SDF-1含量,結(jié)果顯示:2D組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P=0.000;Transwell組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P=0.000;2D組高于MSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P=0.000;Transwell組高于MSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P=0.000;2D組高于Transwell組,P=0.017。(2)培養(yǎng)第7天,采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中VEGF含量,結(jié)果顯示:2D組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P=0.0000;Transwell組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P=0.000;2D組高于MSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P=0.000;Transwell組高于MSC單獨(dú)培養(yǎng)組,P=0.000;2D組高于Transwell組,P=0.009。(3)計(jì)數(shù)法檢測(cè)共培1、3、5、7天各組MSC數(shù)量,結(jié)果顯示:MSC細(xì)胞數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,自第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,2D和Transwell共培養(yǎng)組的MSC數(shù)量均高于MSC單獨(dú)培養(yǎng)組,2D共培養(yǎng)組細(xì)胞數(shù)量高于Transwell共培養(yǎng)組,以第7天最為明顯。(4)對(duì)第7天HSC細(xì)胞數(shù)量、MSC細(xì)胞數(shù)量、SDF-1含量、VEGF含量進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示:SDF-1、VEGF與HSC、MSC細(xì)胞數(shù)量間呈明顯正相關(guān)(P0.05)。結(jié)論:1.與間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)的造血干細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)于單獨(dú)培養(yǎng)的造血干細(xì)胞,且2D接觸共培養(yǎng)的模式對(duì)造血干細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用優(yōu)于非接觸共培養(yǎng)模式。2.2D接觸共培養(yǎng)模式促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖作用更強(qiáng)的機(jī)制可能有以下幾點(diǎn):(1)MSC與HSC在2D接觸共培養(yǎng)模式下,分泌了更多的血管生成因子(VEGF)和趨化因子(SDF-1)。(2)SDF-1和VEGF的分泌具有相關(guān)性,共同促進(jìn)了HSC和MSC的增殖。(3)HSC對(duì)MSC增殖的具有促進(jìn)作用,MSC的增殖能力在接觸共培養(yǎng)模式下較非接觸共培養(yǎng)模式更強(qiáng),增殖的MSC進(jìn)一步促進(jìn)了HSC的增殖,從而形成良性循環(huán),增強(qiáng)了HSC的增殖能力。3.相較于HSC單獨(dú)培養(yǎng)模式和非接觸共培養(yǎng)模式而言,2D接觸共培養(yǎng)模式能模擬一個(gè)更加接近于自然狀態(tài)下的骨髓微環(huán)境,因此更加有利于造血干細(xì)胞的體外增殖。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R329.2
【圖文】：

圖 1 分離出的小鼠股骨（箭頭標(biāo)示處可見股骨頭完好）Figure 1 Theisolated mouse femur圖 2 分離出的小鼠脛骨Figure 2 The isolated mouse tibia(The arrow mark shows the femoral head intact visible)4.1.2 原代培養(yǎng)（1）將細(xì)胞懸液吹打混勻并計(jì)數(shù)細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×107個(gè)/ml，每瓶 3ml 細(xì)胞懸液，接種于 25cm 培養(yǎng)瓶中。置于 37 ℃、5 ％CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。將這代細(xì)胞標(biāo)記為 P0 代細(xì)胞。（2）接種細(xì)胞后 48 小時(shí)半量換液一次。吸取上層培養(yǎng)基 1.5ml，棄于廢液桶，并加入新鮮培養(yǎng)基 2ml，吹打混勻。以后每 48h 全量換液

圖 1 分離出的小鼠股骨（箭頭標(biāo)示處可見股骨頭完好）Figure 1 Theisolated mouse femur圖 2 分離出的小鼠脛骨Figure 2 The isolated mouse tibia(The arrow mark shows the femoral head intact visible)4.1.2 原代培養(yǎng)（1）將細(xì)胞懸液吹打混勻并計(jì)數(shù)細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×107個(gè)/ml，每瓶 3ml 細(xì)胞懸液，接種于 25cm 培養(yǎng)瓶中。置于 37 ℃、5 ％CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。將這代細(xì)胞標(biāo)記為 P0 代細(xì)胞。（2）接種細(xì)胞后 48 小時(shí)半量換液一次。吸取上層培養(yǎng)基 1.5ml，棄于廢液桶，并加入新鮮培養(yǎng)基 2ml，吹打混勻。以后每 48h 全量換液

圖 3 分離出的 GFP 小鼠腿骨（可見股骨頭完好，肌肉組織呈綠色Figure 3 Isolated GFP mouse leg (visible femoral head intact, muscle tissugreen)2.2 密度梯度離心法獲取小鼠骨髓 MNC1）將獲得的細(xì)胞懸液混勻，濾網(wǎng)過濾去除骨渣。1200 r 離心去上清液，用 1.5 mlPBS 重懸并吹打混勻。2）小鼠 Ficoll 分離液提前復(fù)溫，移液管吸取 2 ml 加入離心用移液槍沿管壁緩慢注入上述已混勻的細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液，避免 2 者混合，可見明顯的分界線。（圖 4）20 ℃、400 min。

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4 汪姝s

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