發(fā)布時間：2020-07-24 13:32

【摘要】：目的1檢測可變剪接體OSTα2在不同動物(家兔、小鼠、大鼠)和人的組織表達譜;檢測膽汁淤積或者膽汁酸負荷時,以及肥胖和高脂飲食引起的脂代謝異常時OSTα與OSTα2的表達改變。2檢測可變剪接體OSTα2對OSTα與OSTβ的相互作用及膜定位的影響。方法1利用PCR、半巢式PCR定性檢測不同動物和人組織中OSTα和OSTα2的表達情況;利用實時定量PCR檢測膽管結扎或口服膽汁酸負荷時,以及肥胖和高脂飲食引起的脂代謝異常時小鼠回腸OSTα及OSTα2的表達改變。2利用PCR技術擴增小鼠OSTα、OSTα2和OSTβ的編碼序列,克隆到表達載體pc DNA3.1(-)中�；蚓幋a序列克隆入載體p Bi FC-VC155和p Bi FC-VN155以進行Bi FC分析,克隆入p EGFPN2構建GFP融合蛋白。利用Bi FC和GFP融合蛋白分析蛋白的相互作用與膜定位。結果1 PCR定性檢測顯示OSTα和OSTβ在所有檢測組織中均有表達,OSTα2在除卵巢外的所有檢測組織表達。提取各組小鼠回腸RNA,逆轉錄后實時定量PCR分析顯示:膽總管結扎(bile duct ligation,BDL)后OSTα、OSTα2及OSTβ的表達水平在3天(BDL3d)組均顯著降低,OSTβ的表達水平在BDL7d組也明顯降低;�；悄懰�(taurocholate acid,TCA)處理后,OSTα在TCA10d和TCA20d表達水平顯著升高,而OSTα2及OSTβ的表達水平僅在TCA10d組明顯升高;消膽胺(cholestyramine,CY)處理組變化不明顯;與對照的db/m小鼠相比,db/db小鼠回腸OSTα和OSTα2的m RNA表達水平均升高;高脂飲食喂養(yǎng)3個月所致的營養(yǎng)性肥胖小鼠,實時定量PCR結果顯示OSTα在回腸的表達顯著高于對照組;回腸OSTα2表達水平沒有明顯改變。2利用Bi FC技術和GFP融合蛋白分析,共聚焦顯微鏡下結果顯示:OSTα和OSTβ共表達綠色熒光定位于細胞膜;OSTα2單獨表達形成的同源二聚體定位于胞漿;OSTα2和OSTβ可形成異二聚體,但綠色熒光定位于胞漿中;OSTα和OSTβ中加入等量OSTα2后,綠色熒光主要定位于細胞漿中。結論1膽總管結扎小鼠回腸OSTα、OSTα2及OSTβ表達降低,而膽汁酸負荷小鼠回腸的OSTα、OSTα2及OSTβ表達增加。2 OSTα2通過與OSTα競爭結合OSTβ,干擾OSTα-OSTβ復合物的形成以及亞細胞定位和功能,表現(xiàn)為顯性負效應。
【學位授予單位】：華北理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R363
【圖文】：

圖 1 跨剪接位點設計引物Fig.1 Primers designed for cross splicing sites熒光定量 PCR 檢測步驟有 cDNA 樣品分別配置實時定量 PCR 反應體系：SYBR-G4μl；下游引物 0.4μl；待測樣品 cDNA 4μl；ddH2O 5.2μl；壁做好分組標記，避光且冰上加樣，輕彈管底將溶液混合，al-time PCR 儀開機預熱 30min，將配置好的 PCR 反應溶液置行實時定量擴增反應。反應條件設置為：95 ℃ 2min 預變性2 ℃ 20s，共 40 個循環(huán)；最后 95℃ 15s 延伸后退火。泳檢測：目的基因和內參基因進行 Real-time PCR 反應后，r 進行 1％瓊脂糖凝膠電泳，鑒定 PCR 產物是否為單一特異果

圖 4 膽總管結扎小鼠回腸 OSTα 的表達改變Fig.4 Changes of ileal OSTα expression in mice following common bile duct ligation注：OSTα 和 OSTα2 在 TCA10d 組及 TCA20d 組的表達均明顯增高；OSTβ 的表達水平在 TCA10d 組也顯著升高，OSTα2/OSTα 比值在 TCA10d 組及 TCA20d 組降低（*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, n=6）。圖 5 TCA 處理小鼠回腸 OSTα 的表達改變Fig.5 Changes in the expression of ileal OSTα in TCA treated mice

YFP）的變異體 Venus 蛋白的 1-155 氨基酸殘基（VN）融合到 OSTα 的 C 端，將Venus 蛋白的 156-238 氨基酸殘基（VC）融合到 OSTβ 的 C 端。當 OSTα 與 OSTβ相互作用使得 Venus 蛋白重建，可發(fā)出綠色熒光。共聚焦顯微鏡下觀察結果顯示，OSTα-VN+OSTβ-VC 綠色熒光與紅色熒光重疊顯示黃色熒光，說明二者結合定位于細胞膜，符合其作為轉運體的功能定位（圖 8A）；OSTα2-VN+OSTα2-VC 綠色熒光定位于胞漿，說明 OSTα2 可以形成同源二聚體，但不能定位到膜上行使功能性作用（圖 8B）；OSTα2-VN+OSTβ-VC 綠色熒光定位于胞漿中，與細胞膜染料的紅色熒光不重疊，說明 OSTα2 可與 OSTβ 形成復合體，但該復合體不能轉位至細胞膜執(zhí)行轉運體功能（圖 8C）；OSTα-VN+OSTβ-VC+OSTα2 綠色熒光主要定位于細胞漿中，僅少量定位于細胞膜（圖 8D）。

【參考文獻】

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1 田景惠;趙躍然;;HBV受體Na~+-牛磺膽酸共轉運多肽(NTCP)研究新進展[J];中國病原生物學雜志;2015年07期

2 庫爾班江·阿布都西庫爾;王建設;;有機溶質轉運體α-β在膽汁酸代謝及膽汁淤積癥中的作用[J];肝臟;2012年08期

3 王會敏;王正平;董e

本文編號：2768913